不同貝殼煅燒粉的殺菌及抑菌效果

, , , , ,徐君

(1.舟山出入境檢驗檢疫局,浙江舟山 316021; 2.浙江海洋大學,浙江舟山 316021)

食品保鮮技術主要包括物理、化學和生物方法。物理方法因使用范圍、操作技術等限制,推廣受限,如微波殺菌難以評估殺菌的效果和安全性[1];紅外殺菌穿透力并不強,只適合食品表面殺菌[2];輻照殺菌的機理及輻射降解藥物殘留的安全性有待進一步研究[3]。化學防腐劑如亞硝酸鹽、苯甲酸鈉等都具有一定的毒性,而生物保鮮具有無毒、無味、安全等特點。因此尋找安全無毒的生物保鮮方法,用于取代化學保鮮方法已成為人們關注的熱點。目前，在抗菌保鮮天然成分的研究上,較多的集中在從陸生植物中提取的抗菌活性成分方面,而從海洋生物中尋找抗菌活性成分的研究,雖然涉及到殼聚糖、海藻低聚糖等,但與海洋巨大的資源相比,是遠遠不夠的。

我國貝殼資源極其豐富且品種繁多,近年來貝類的產(chǎn)量和加工量每年已達到數(shù)百萬噸甚至上千萬噸[4],但同時產(chǎn)生大量的廢棄物,每年都有數(shù)百萬噸的空貝殼被丟棄在海岸邊,破壞環(huán)境。因此國內(nèi)外學者開始關注廢棄貝殼的利用。在環(huán)境治理領域,有報道稱將貝殼熱解成CaO,可除富營養(yǎng)化水體中的磷污染[5]、去除廢水中的重金屬[6-7],在生物濾池中加貝殼作為填料,可用于工業(yè)廢水處理[8]。在食品領域,除部分貝殼作為肥料和禽畜飼料的添加劑外[9],研究還表明，煅燒貝殼粉可以用于去除水果蔬菜表面農(nóng)藥殘留[10],具有較強的除菌和脫臭能力[11],經(jīng)高溫灼燒后制取活性氧化鈣,對豬瘦肉、豆腐干[12]、儲糧霉菌[13]具有防腐抑菌效果。任慧等[14]研究了扇貝對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,魏巍等[15]用扇貝對黃瓜、單環(huán)刺縊扇貝進行了抑菌實驗,但未見系統(tǒng)地研究貝殼粉煅燒物對常見致病菌的殺菌及抑菌效果的報道。因此,本文選取文蛤、貽貝、縊蟶這3種常見貝殼,經(jīng)高溫煅燒獲得貝殼煅燒粉,評估其對常見致病菌的殺菌以及抑菌能力,研究貝殼煅燒粉作為天然保鮮劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

文蛤、貽貝、縊蟶 浙江省舟山市南珍鮮活海產(chǎn)品市場;大腸埃希氏菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙門氏菌(CMCC50115) 廣東省微生物菌種保藏中心;副溶血弧菌(CICC 21617) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;腦心浸液肉湯、DHL瓊脂、Barid-Parker瓊脂、EMB瓊脂、TCBS瓊脂 北京陸橋生物技術有限公司;氯化鈉(分析純) 國藥集團;菌落計數(shù)紙片 3M公司。

SX2-2.5-12型高溫馬福爐 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;QE型高速中藥粉碎機 武義縣屹立工具有限公司;BK1610培養(yǎng)箱 THERMO德國公司;KS12生物安全柜 THERMO德國公司;MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋;ME2002E電子天平 瑞士梅特勒公司;IKA MS3混合器 廣州儀科實驗室技術有限公司;Advantage10純水儀 德國Milipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 貝殼煅燒粉的制備 材料預處理:將貽貝、文蛤、溢蟶于適量水中煮至貝殼自然開口,取出貝殼閉殼肌及內(nèi)臟等內(nèi)容物,將貝殼沖洗干凈,于自然條件下晾干,稱取適量于中藥粉碎機中粉碎5 min,粉碎3次,過150目篩,備用。

高溫煅燒:稱取適量粉碎好的貝殼粉于6個坩堝中,每2個坩堝設為一組,每組溫度分別為1000 ℃,煅燒時間為2 h。然后將貝殼粉置于烘箱中,以180 ℃烘干20 min,于干燥器內(nèi)冷卻后備用。通過稱量貝殼粉灰化前后質(zhì)量,計算貝殼粉失重率,確認貝殼粉灰化完全[16]。

1.2.2 貝殼煅燒粉懸濁液的制備 將1.2.1所得的3種貝殼煅燒粉,用0.85% NaCl生理鹽水配成10%濃度的母液備用。根據(jù)實驗需要,將10%濃度的貝殼煅燒粉母液稀釋成1%、0.1%、0.01%濃度的貝殼煅燒粉懸濁液。

1.2.3 受試菌株準備 將實驗室保藏的菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和沙門氏菌接種于腦心浸液肉湯(副溶血弧菌為鹽度2% NaCl的腦心浸液肉湯)培養(yǎng)基,36 ℃活化培養(yǎng)(24±2) h后,分別劃EMB平板、Baird-Park平板,TCBS平板和DHL平板,36 ℃培養(yǎng)(24±2) h,分別挑取典型單菌落接種于90 mL的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中(副溶血弧菌接種到2% NaCl的腦心浸液),36 ℃培養(yǎng)(18±2) h,使每毫升培養(yǎng)液中初始菌數(shù)達108CFU/mL以上,作為受試菌株。利用3M菌落總數(shù)測試片進行菌落總數(shù)測定。

1.2.4 貝殼煅燒粉抑菌能力的測定

1.2.4.1 貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用研究 吸取10%濃度的貝殼煅燒粉懸浮液10 mL,分別加入到90 mL含不同菌的菌懸液中,制成1%濃度的貝殼煅燒粉混合液。該混合液中,初始菌達108CFU/mL以上,分別于26 ℃下作用1、5、10、20、30 min后,適當稀釋后,利用3M紙片進行菌落計數(shù)。

1.2.4.2 貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用研究 本實驗采用瓊脂擴散法的牛津杯[17]評價貝殼粉抑菌劑的抑菌活力。通過抑菌圈直徑的大小來確定抑菌劑抑菌能力的強弱。將復活的菌種接種于盛有普通細菌培養(yǎng)基的克氏瓶中,36 ℃培養(yǎng)(20±2) h后,用滅菌生理鹽水洗下菌苔,制成菌懸液。將菌懸浮液接種至pH7.2的瓊脂液(副溶血弧菌接種到含2% NaCl的瓊脂液)中,直至濃度為5×105CFU/mL瓊脂。將20 mL被接種過的瓊脂液倒在平板上,然后放在冷的平板上冷卻。

用無菌鑷子將滅菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中,在水平放置的培養(yǎng)皿中均勻放置3只牛津杯。用移液槍精準吸取0.1、0.01、0.001 g/mL三個濃度的貝殼粉抑菌劑200 μL至牛津杯中。同時吸取無菌水作為對照。將加入抑菌劑的培養(yǎng)皿在(3～4) ℃冰箱中靜置30 min,然后在受試菌最適生長溫度37 ℃下,培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑。平行實驗3次,求其平均值。

2 結果與分析

2.1 不同貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用

由表1～表3可知,3種貝殼煅燒粉對4種菌均具有殺菌作用,但殺菌效果不同。貽貝殼煅燒粉對4種菌的作用大小為:大腸桿菌>副溶血弧菌>沙門氏菌>金黃色葡萄球菌;文蛤殼煅燒粉:副溶血弧菌>大腸桿菌>沙門氏菌>金黃色葡萄球菌;縊蟶殼煅燒粉:副溶血弧菌>大腸桿菌≈沙門氏菌>金黃色葡萄球菌。相比于大腸桿菌、沙門氏菌以及副溶血弧菌,3種貝殼煅燒粉對金黃色葡萄球菌的殺菌作用較弱,表明3種煅燒貝殼粉對于G-菌的殺菌作用明顯大于G+菌。推測可能由于G+菌因細胞壁由肽聚糖及磷壁酸所組成,結構堅硬且較厚;G-菌細胞壁所含的肽聚糖較薄,約為革蘭氏陽性菌細胞的十分之一,且無強化功能的磷壁酸,故較為脆弱,而其外層含有脂蛋白、磷脂、脂多糖等,于堿性環(huán)境下易受破壞而變性。

表1 貽貝貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用Table 1 Bactericidal effect of calcined shell powder of Mussels on food borne pathogens

表2 文蛤貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用Table 2 Bactericidal effect of calcined shell powder of Meretrix meretrix on food borne pathogens

表3 縊蟶貝殼煅燒粉對食品病原菌的殺菌作用Table 3 Bactericidal effect of calcined shell powder of Sinonovacula constricta on food borne pathogens

相比于貽貝、文蛤,縊蟶對于4種菌的作用效果相對較強。對于沙門氏菌的殺菌作用,縊蟶>貽貝=文蛤,縊蟶作用10 min 后沙門氏菌小于10 CFU/mL;對于副溶血弧菌,作用效果最好的為文蛤以及縊蟶殼煅燒粉,作用5 min后,均小于10 CFU/mL;對于大腸桿菌,3種煅燒粉作用對其作用基本相同,作用10 min后均小于10 CFU/mL。對于金黃色葡萄球菌,縊蟶=貽貝>文蛤。

2.2 不同貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用

由培養(yǎng)基擴散法初步確定貝殼煅燒粉對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和大腸桿菌的抑菌能力大小。根據(jù)文獻[18]對抑菌作用的判斷:抑菌圈直徑小于或等于7 mm者,判為無抑菌作用。抑菌圈直徑大于7 mm者,有弱抑菌作用;抑菌圈在(10～20) mm者,有中等抑菌作用。抑菌圈直徑大于20 mm者,有強抑菌作用。由表4～表6,貝殼粉有抑菌作用,且不同貝殼粉對不同菌的抑菌效果不同。貽貝貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌性明顯強于沙門氏菌以及大腸桿菌,且在0.1 g/mL濃度下貽貝貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌作用最強,抑菌圈直徑達16.24 mm。文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌性明顯強于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌,且在0.1 g/mL濃度下文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌作用最強,抑菌圈直徑達16.00 mm。縊蟶殼煅燒粉在高濃度即0.1 g/mL對沙門氏菌的作用最強,抑菌圈達16.42 mm,但在低濃度時,對副溶血弧菌的抑菌作用最強,抑菌圈達9.46 mm。

表4 貽貝貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用Table 4 Inhibitory effect of calcined shell powder of Mussels on food borne pathogens

表5 文蛤貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用Table 5 Inhibitory effect of calcined shell powder of Meretrix meretrix on food borne pathogens

表6 縊蟶貝殼煅燒粉對食品病原菌的抑菌作用Table 6 Inhibitory effect of calcined shell powder of Sinonovacula constricta on food borne pathogens

3 結論

本文通過對沙門氏菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌進行菌液的殺菌實驗以及培養(yǎng)基擴散法的抑菌實驗。結果表明，3種貝殼煅燒粉對4種菌均具有殺菌作用,但對金黃色葡萄球菌的殺菌作用較弱,對于G-菌的殺菌作用明顯大于G+菌。作用最強的為縊蟶及文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌，作用5 min后菌落總數(shù)均小于10 CFU/mL。由培養(yǎng)基擴散法的抑菌實驗表明，3種貝殼煅燒粉對4種菌均有抑菌作用：抑菌效果最強為縊蟶貝殼煅燒粉在0.1 g/mL濃度下作用于沙門氏菌，抑菌圈直徑達16.42 mm；在各濃度階段，貽貝和文蛤貝殼煅燒粉對副溶血弧菌的抑菌性明顯強于于沙門氏菌以及大腸桿菌。因此不同的貝殼煅燒物都有一定的殺菌和抑菌作用,但效果有差異。因此進一步對貝殼煅燒粉的成分進行分析,將有助于對殺菌以及抑菌機理及效果的研究。本研究為貝殼煅燒粉用作食品抑菌劑進行了初探。