基于電子鼻技術的馬鈴薯真菌性腐爛病早期檢測

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(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

馬鈴薯所含營養成分豐富,是世界上的第四大糧食作物。中國是全球第一大馬鈴薯生產國,馬鈴薯產量及消費面不斷擴大,其種植面積也在相應擴增[1]。馬鈴薯在生長和貯藏期都易受各種病菌的侵染而發生不同程度的腐爛,且腐爛極易擴散,造成巨大的經濟損失[2]。隨著我國馬鈴薯主食化戰略的提出,由馬鈴薯腐爛造成的經濟損失進一步引起人們的關注,對腐爛樣本進行檢測并及時剔除,減少因感染而引起的大面積腐爛變得尤為重要。

現階段常用的馬鈴薯腐爛的無損檢測方法主要有機器視覺、近紅外、高光譜等檢測方法,與人工相比，無損檢測方法提高了檢測速度,但存在檢測指標片面、數據處理復雜等不可忽略的缺點[3-4]。面對現有檢測方法的局限性,能否建立一種快速的無損檢測方法,對由致病菌引起的馬鈴薯腐爛樣本進行檢測,及時剔除腐爛潛伏期、早期和中期的樣本,減少因感染而引起的大面積腐爛已成為影響農民增收的一個關鍵問題。

真菌侵染后的樣本隨時間的延長其菌種含量逐漸增多,菌種活性不斷增強,所產生的代謝產物的量也不斷增加,進而導致樣本所釋放的氣體種類及強度不斷變化。因此本文提出采用電子鼻技術對真菌性腐爛病進行快速檢測。電子鼻是一種由氣敏傳感器陣列和適當的模式識別方法組成的智能氣味檢測設備,主要用來檢測、分析以及辨別樣本的整體氣味信息。近年來,國內外學者Massimo F Rutolo、E Biond、朱娜、蔣雪松等[5-8]也探索了電子鼻在檢測馬鈴薯、草莓腐爛和食品微生物污染中的可行性,均取得了較理想的效果。由真菌導致的馬鈴薯腐爛病早期樣本外部無明顯變化,因此不能直接得到檢測樣本,有關馬鈴薯腐爛病檢測方法研究的現有報道中,均需通過侵染實驗制備得到各階段樣本,且所用菌種多通過直接購買得到,但不同地區馬鈴薯主要致腐菌各不相同,因此對實際應用指導性不強。本文首先從自然存放過程中腐爛的馬鈴薯中分離鑒定出主要致腐菌,以此菌種為病原菌進行侵染實驗,制備得到馬鈴薯腐爛樣本,用于電子鼻檢測。使用電子鼻技術與模式識別算法相結合,對侵染不同階段的樣本進行判別,以期為馬鈴薯早期腐爛檢測提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

馬鈴薯 鎮江農戶,將樣本室溫下存放待用;菌株M-5 分離于存放過程中自然腐敗的馬鈴薯,經純化后低溫保存于本實驗室;馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA,g/L) 馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂粉20,蒸餾水1000 mL,pH自然;DNA抽取試劑盒、PCR反應試劑、核酸提取所需試劑、DNA Marker 上海生工。

電子鼻 圖1,由江蘇大學食品、農產品品質無損檢測技術研究中心自主研制;恒溫恒濕箱SPX系列 上海瑯玕實驗設備有限公司;生物顯微鏡(MR-2000) 江南光學儀器廠;電泳儀(DYY-12型) 北京六一公司;ABI基因擴增儀 美國ABI公司;GR85DR型全自動高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司。

圖1 電子鼻系統結構示意圖 Fig.1 The schematic diagram of electronic nose system注:1:集氣室,2:待測樣本,3:泵,4:反應氣室,5:傳感器,6:電磁閥a,7:氣路管路,8:電磁閥b,9:氧氣罐,10:計算機。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化與篩選 采用組織分離法分離菌種:在無菌操作臺上,將存放過程中自然腐爛的馬鈴薯用75%酒精進行表面消毒,用滅菌后的藥匙挖取適量腐爛組織,放入裝有10 mL無菌生理鹽水的試管中,制備成10-1的果肉稀釋液。振蕩混勻后將液體逐級梯度稀釋至10-8。分別選取10-5、10-6、10-7、10-8四個稀釋梯度,取適量懸濁液涂布,置于25 ℃恒溫恒濕箱內培養。經多次純化后獲得單菌落平板,4 ℃存放備用。

將分離純化得到單菌落接種至正常馬鈴薯中,每株菌種感染20個正常樣本,持續2個月觀察感染樣本的腐爛狀況,依據腐爛結果篩選出致腐爛菌,用于后期腐爛樣本的制備。

1.2.2 致腐菌分子鑒定 篩選得到的致腐菌進行分子鑒定,確定其菌體菌種。具體操作如下:

DNA提取:采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽取試劑盒進行DNA提取,略作修改。

PCR擴增體系25 μL:加入12.5 μL supermix酶、ITS1和ITS4引物各加入1 μL,2 μL樣品和8.5 μL的超純水。PCR反應條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min;循環30次;72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后,進行瓊脂糖凝膠電泳實驗,驗證是否獲得目的片段。確定獲得目的片段后將其送往上海生物工程技術服務有限公司進行基因測序。

1.2.3 腐爛樣本制備 以鑒定得到的馬鈴薯主要致腐菌為病原菌,采用整薯刺傷接種法[9]制備得到腐爛樣本。具體操作如下:選取完好整薯120個,大小適中,經消毒預處理后進行打孔接菌。用滅菌后的打孔器在每個整薯上打4個孔,4個孔沿縱軸方向均布,每個孔垂直于縱軸。將培養好的致腐菌A.pullulans的單菌落刮至裝有5 mL生理鹽水的試管中,制備成菌懸液。用移液器吸適量菌懸液注射至孔內,每個整薯沿縱軸方向連續接種3個點,最后一個點接相同體積的無菌水做為對照。經血球計數板計測,接種菌濃度為2×108CFU/mL,樣本接菌后在28 ℃,95% RH的恒溫恒濕箱中培養。制備得到的馬鈴薯被分為三個階段,且每階段樣本數為30個。第一階段潛伏期,接種5 d后外部并無異樣;第二階段感染早期,接種18 d后樣本外部可觀察到霉菌絲;第三階段感染中期,接種35 d后樣本外部開始腐爛。

所有階段樣本先采用電子鼻進行測定,然后將薯塊沿縱軸切開,測量腐爛斑的最大直徑,求出平均值。

1.2.4 電子鼻測定 采用圖1所示電子鼻進行檢測,傳感器陣列主要由TGS832、WSP2110、TGS822、TGS813、TGS880、TGS2610、TGS2611、TGS2620組成。將侵染制備得到的馬鈴薯腐爛樣本分別放入800 mL圓柱形無味玻璃容器中進行集氣,集氣時間為40 min,從而獲得頂空氣體;電子鼻預熱3 h,每次電子鼻檢測開始前,使用氧氣對電子鼻系統進行還原,還原完成后,電子鼻抽取密閉容器中的頂空氣體,對馬鈴薯樣品進行檢測;檢測過程中按照1次/s的速率記錄傳感器響應信號,共采集420個信號值;120個樣本依次進行測定,從而得到傳感器陣列對不同檢測樣品的響應曲線。

1.3 數據處理

獲得菌株序列后,通過NCBI網站進行序列比對分析。然后運用DNAStar軟件,生成系統發育樹進行同源性及聚類分析。

電子鼻測定得到的信號曲線趨于穩定時,表明樣本氣體已與傳感器充分反應,因此選用穩定值的平均值作為特征變量進行建模。從120個測定樣本中隨機選取80個樣本作為訓練集,40個樣本作為預測集,分別建立K最近鄰和BP-神經網絡判別模型,對接菌后不同階段的馬鈴薯進行判別,所有數據分析均在MATLAB 2010.b軟件上實現。

2 結果與分析

2.1 致腐爛菌種的鑒定

分離純化后共得到5株菌株,2個月后各菌株感染實驗結果如下:接種菌種1與菌種3的樣本無明顯變化,樣本切開后孔徑內壁已干結并無腐爛現象;接種菌種4的樣本外部有黃綠色霉斑,切開后孔徑內為黃綠色斑點但并未腐爛;接種菌種5的樣本初期外部有黑色菌絲生長,后期外部開始腐爛,切開樣本后內部均發生不同程度的腐爛。依據致腐爛性驗證實驗結果,確定出菌種5(M-5)為馬鈴薯主要致腐菌,其菌落形態如圖2所示。

圖2 菌種M-5菌落圖Fig.2 Bacterial M-5 colony map

菌株M-5的ITS區擴增產物與蛋白Marker擴增產物電泳圖如圖3所示,對比后確定此菌株ITS區長度約600 bp。回收DNA片段并測序,得到菌株的ITS序列。對上述PCR擴增產物進行序列測定(圖4),將序列在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行同源性比較(BLAST),并構建系統發育樹,結果如圖5所示。經系統發育樹匹配后M-5菌種與Aureobasidiumpullulans同源性為100%,結合形態觀察,最終鑒定菌株5為出芽短梗霉菌A.pullulans。經查,果蔬微生物生態學研究中有關于A.pullulans分離株的報道[10],但關于出芽短梗霉在馬鈴薯腐爛樣本中的報道還未發現。

圖4 M-5菌株ITS區序列Fig.4 ITS sequence of A.pullulans

圖5 根據ITS序列構建的系統發育樹Fig.5 The phylogenetic tree based on ITS sequence

圖3 ITS區PCR產物電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of ITS PCR products注:Marker為蛋白標準物,M-5為待測菌株5。

2.2 不同腐爛階段的馬鈴薯樣本識別

經電子鼻測定后,采集得到侵染后各腐爛階段馬鈴薯樣本的氣味信息值,如圖6中(a)和(b)分別為腐爛潛伏期與腐爛中期樣本響應曲線。由圖6可知，當采集值370 s時樣本值已達到穩定,因此提取380～400 s的平均值作為馬鈴薯品質判別的特征值,建立馬鈴薯腐爛階段判別模型。

圖6 樣本傳感器響應曲線Fig.6 Response curve of electronic nose

2.2.1 馬鈴薯腐爛階段的K最近鄰法判別分析 對腐爛潛伏期、早期和中期三個階段樣本的內部腐爛直徑進行統計,分別為(3.55±0.6)、(5.48±1.05)、(7.22±2.1) mm。建模時,考慮了不同主成分數和最近鄰樣本個數對模型的影響,采用留一法交互驗證的方式對這兩個參數進行優化,得到性能最佳模型,結果如圖7所示,當主成分數為6,K值為4時模型判別效果最優,其中訓練集的識別率為90%,預測集識別率為85%。模型中正常樣本與侵染樣本被完全區分開,誤判主要發生在潛伏期與早期之間,共有5個潛伏期樣本被誤判為早期。主要原因是侵染后這些樣本中菌種橫向生長,故雖外部未有異樣,但內部腐爛直徑接近5.5 mm,樣本氣體強度與感染早期樣本相近,因此誤判。共有1個腐爛早期樣本被誤判為潛伏期,主要是接種后菌種縱向生長,樣本孔徑外部雖有菌絲長出,但內部腐爛程度不足4 mm,氣體強度較弱。

圖7 KNN模型訓練集和預測集的識別能力Fig.7 Discrimination rates of training set and prediction set by KNN model

2.2.2 馬鈴薯腐爛階段的人工神經網絡判別分析 誤差反向傳播神經網絡(Back propagation artificial neuron network,BP-ANN)是一種反向傳遞并修正誤差的多層映射神經網絡,一般用來處理非線性的分類問題、兩個相關數據矩陣間復雜的非線性模型關系[11-12]。模型參數設置如下:隱含層數為12,最大迭代次數1000,學習速率0.1,動量因子0.7,訓練目標為誤差≤10-8。模型結果如表1所示,樣本訓練集的正確率為93.75%,測試集的正確率為90.00%,預測集準確率相比KNN模型提高了5%。表1顯示，誤判主要發生在腐爛中期,主要原因是此三個樣本雖外部腐爛直徑較大,但其腐爛深度較淺,因此氣味信息較淡,被誤判為腐爛潛伏期與早期。所建的BP-ANN模型將正常樣本與腐爛各階段樣本進行較好區分,潛伏期樣本與早期樣本之間不再重疊。此結果表明,利用電子鼻技術與BPANN判別模型相結合,不僅可以實現對腐爛早期樣本的識別，還可以對侵染后各階段樣本進行較精確的區分,及時將侵染樣本與正常樣本進行區分,避免因感染而導致的不必要損失,為后期電子鼻技術應用至馬鈴薯腐爛早期檢測提供理論依據。

表1 BP神經網絡判別結果Table 1 Discrimination results of BP-ANN

3 結論

本研究從存放過程中自然腐爛的馬鈴薯中分離、純化并鑒定出馬鈴薯致腐爛菌種,將鑒定出來的主要致病菌對樣本進行侵染;采用電子鼻技術對浸染后不同階段的腐爛樣本進行檢測,探討了電子鼻對馬鈴薯腐爛早期識別的可行性。依據常帆等人的研究可知，出芽短梗霉代謝產物中有較多的淀粉酶和果膠酶[13]。此菌在馬鈴薯樣本中寄存生長后將導致樣本內部組織分解,進而腐爛。本實驗表明，出芽短梗霉在一定環境條件下,作為馬鈴薯致腐爛的主要菌種,導致大量的經濟損失。馬鈴薯在致病菌的作用下不斷腐爛,腐爛不同階段產生的氣體成分種類和含量會有所不同,采用電子鼻技術對樣本進行檢測。建立KNN線性判別模型后訓練集識別率為90%,預測集識別率為85%,可見電子鼻對侵染后樣本檢測是有效的。采用BP-ANN模型對不同腐爛階段的馬鈴薯樣本進行判別,其模型識別率訓練集為93.75%,預測集為90.00%,所建BPANN模型不僅可以將正常樣本與腐爛樣本進行區分,還對腐爛各階段進行了較好的識別。此結果表明了將電子鼻應用于馬鈴薯早期腐爛檢測的可行性,為后期電子鼻在馬鈴薯檢測中的應用提供理論依據。