凝結芽孢桿菌中與乳酸生產相關的乳酸脫氫酶基因的研究

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(華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237)

乳酸的首次發現可以追溯到1780年,它被Scheele在酸乳中發現[1]。乳酸在發酵和人類食品方面的應用有著悠久的歷史[2]。乳酸是一種多用途天然有機酸,現今還應用于醫藥、化妝品和化工等領域[3]。乳酸的分子結構簡單,但含有不對稱碳源,有兩種光學異構體:L(+)-乳酸和D(-)-乳酸[3]。乳酸已被美國食品藥品監督管理局(FDA)列為安全的(GRAS)食品添加劑,但D(-)-乳酸對人體代謝是有害的,可能導致酸中毒和脫鈣作用[4]。

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)具有較高的乳酸生產能力[5],屬于革蘭氏陽性菌,細胞壁硬(或厚),細胞呈桿狀,細胞兩端產芽孢,無鞭毛[6]。凝結芽孢桿菌的生長溫度為45～60 ℃,是一種嗜熱菌,耐酸能力極強,可在pH小于2.4的培養液中存活一年,最適pH在4.5～6.5之間[7]。凝結芽孢桿菌最早是在變質的牛奶中發現并分離出來[8],后經研究發現其可以利用各種糖類轉化成乳酸,并且具有耐高溫、耐酸,糖酸轉化率高和產乳酸光學純度好等特點。凝結芽孢桿菌有很好的發酵特性,其在50～55 ℃的發酵條件下進行分批發酵和補料發酵生產乳酸的過程可以不用滅菌操作。Qin等[9]在50 ℃培養條件下，不經過滅菌利用凝結芽孢桿菌進行乳酸發酵,獲得了光學純度99%以上的L-乳酸。凝結芽孢桿菌雖然具有很高的商業應用價值,但當前工業上對凝結芽孢桿菌的應用還不是很多,其良好的生物學特性尚未得到充分利用,其原因之一就是對凝結芽孢桿菌乳酸發酵相關基因的了解還很少[10]。

凝結芽孢桿菌乳酸代謝過程是葡萄糖經過糖酵解途徑(EMP)，再經過乳酸脫氫酶催化后生成乳酸[11-12],在凝結芽孢桿菌ATCC7050菌種中存在三種乳酸脫氫基因:ldhL1、ldhL2和ldhD,即L型乳酸生成相關的L-乳酸脫氫酶基因兩個,D型乳酸生成相關的D-乳酸脫氫酶基因一個。本文對5株凝結芽孢桿菌的乳酸發酵特性進行了研究,并以ATCC7050為例，研究了3個乳酸脫氫酶基因轉錄與乳酸合成的關系,對凝結芽孢桿菌代謝研究和基因改造奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)ATCC7050、凝結芽孢桿菌36D1、凝結芽孢桿菌P4-102B、凝結芽孢桿菌HL5、凝結芽孢桿菌HL5-C 均由本實驗室保藏;葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 凌峰化學試劑有限公司(上海);L/D-LACTATE試劑盒 Megazyme公司;葡萄糖試劑盒 科欣生物技術(上海)研究所;RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Dimer Eraser、細菌基因組DNA小量純化試劑盒 寶日醫生物技術(北京)有限公司。

SBA-40E型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;ZWY-211C型恒溫搖床振蕩培養柜 智城分析儀器制造有限公司(上海);UV-2102PC型紫外可見分光光度計 菁華科技儀器有限公司(上海);FE20型pH計 梅特勒-托利儀器;96孔實時定量PCR儀CFX connect 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 LB培養基(g/L)[13],固體培養基再加入2%的瓊脂,pH調節為5.0,用于凝結芽孢桿菌培養。

茄子瓶斜面培養基:葡萄糖40 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉浸膏6 g/L,酵母提取物10 g/L,檸檬酸二胺2 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,乙酸鈉4 g/L,硫酸鎂0.2 g/L,硫酸錳0.2 g/L,瓊脂18 g/L,吐溫-80 1 mL,碳酸鈣10 g/L,NaOH調pH至6.0。

種子培養基:葡萄糖40 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母膏10 g/L,檸檬酸二胺2 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,硫酸鎂0.2 g/L,硫酸錳0.2 g/L,氯化鈉0.03 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L,乙酸鈉4 g/L,吐溫-80 1 mL,碳酸鈣25 g/L,NaOH調pH至6.0。

發酵培養基:葡萄糖90 g/L,蛋白胨13.33 g/L,酵母膏13.33 g/L,硫酸鎂0.0133 g/L,硫酸錳0.0133 g/L,氯化鈉0.0133 g/L,硫酸亞鐵0.0133 g/L,乙酸鈉0.67 g/L,碳酸鈣40 g/L,NaOH調pH至6.0。

1.2.2 凝結芽孢桿菌乳酸發酵培養 取100 μL甘油管中的凝結芽孢桿菌(ATCC7050、36D1、HL5、HL5-C和P4-102B)菌液，均勻涂布于茄子瓶斜面培養基中,50 ℃,12 h,連續培養兩代進行活化,用50 mL滅菌水將活化菌株從茄子瓶斜面培養基中洗脫下來，之后接入(按15% v/v接種量)種子搖瓶培養基中,搖床(50 ℃,100 r/min)振蕩培養12 h后再接入(按15% v/v接種量)發酵搖瓶培養基中,搖床(50 ℃,200 r/min)振蕩培養48 h 。

1.2.3 五種凝結芽孢桿菌乳酸發酵48 h指標的測定

1.2.3.1 L-乳酸和D-乳酸的測定 根據1.2.2方法對五種凝結芽孢桿發酵48 h后,對發酵液進行離心(6000 r/min,4 ℃離心10 min)處理后取上清。按照L/D-LACTATE試劑盒說明，分別對五種凝結芽孢桿菌發酵液中的L-乳酸和D-乳酸含量進行測定。

1.2.3.2 L-乳酸光學純度的計算 根據1.2.3.1方法分別測定五種凝結芽孢桿菌發酵48 h后L-乳酸ML(g/L)和D-乳酸MD(g/L)的生產量,L-乳酸的光學純度計算公式為:

1.2.3.3 殘糖含量的測定 利用葡萄糖試劑盒對五種凝結芽孢桿菌48 h發酵后的殘糖含量進行測定,具體的測定方法參考葡萄糖試劑盒中說明書進行操作。

1.2.4 凝結芽孢桿菌ATCC7050乳酸發酵過程中指標的變化測定 根據1.2.2方法對五種凝結芽孢桿菌進行48 h發酵,但在發酵過程中每隔5 h取一次樣,每次取樣后離心(6000 r/min,4 ℃離心10 min)處理取上清,對每個樣品利用紫外可見分光光度計、pH計、生物傳感分析儀和葡萄糖試劑盒分別進行OD600、pH、L-乳酸和殘糖含量的測定。最后以培養時間作為橫坐標,分別繪制凝結芽孢桿菌OD600、pH、L-乳酸和殘糖的發酵過程曲線。

1.2.5 凝結芽孢桿菌基因組的提取 對凝結芽孢桿菌ATCC7050進行基因組提取。將凝結芽孢桿菌在LB液體培養基進行培養,50 ℃,200 r/min,當OD600達到1～2時,取2 mL菌液到滅菌離心管中,12000 r/min,4 ℃離心2 min收集菌體。利用細菌基因組DNA小量純化試劑盒對菌體進行基因組的提取,具體提取的方法參考試劑盒內說明書進行操作。

1.2.6 凝結芽孢桿菌總RNA的提取 對凝結芽孢桿菌ATCC7050中ldhL1、ldhL2和ldhD三個基因進行轉錄情況分析,分別在菌體培養的對數期(5 h)、穩定期(20 h)和衰亡期(45 h)時收集菌體提取RNA。將凝結芽孢桿菌在LB液體培養基中培養至OD600達到1～2時,取2 mL菌液于滅菌離心管中,12000 r/min,室溫離心2 min收集菌體,之后參考AxyPrep總RNA小量制備試劑盒說明書中的從細菌中提取總RNA的操作步驟進行。

1.2.7 RNA反轉錄cDNA 將提取好的RNA進行逆轉錄形成cDNA,以cDNA為模板進行PCR和RT-PCR檢測,對ldhL1、ldhL2和ldhD三個基因設計三對引物(RTldhL1-F/RTldhL1-R、RTldhL2-F/RTldhL2-R、RTldhD-F/RTldhD-R),引物序列見表1。以cDNA為模板進行PCR擴增,RNA反轉錄cDNA過程按照PrimeScript cDNA Synthesis Kit說明書進行操作。

表1 實驗中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.8 RT-PCR反應 在八聯管中加入SYBR Premix Dimer Eraser(2×)10 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,模板cDNA 2 μL,滅菌蒸餾水 6 μL。RT-PCR反應條件為95 ℃,30 s;95 ℃,5 s,60 ℃,30 s,40個循環;4 ℃,維持。反應結束后,可以得到其擴增曲線并可根據循環數進行分析。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次,數據采用SPSS軟件處理并用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 五種凝結芽孢桿菌乳酸發酵48 h指標(生長情況)的測定

測定結果見表2,五種凝結芽孢桿菌L型乳酸的產量明顯比D型乳酸的產量高,并由此可以計算出五種凝結芽孢桿菌L-乳酸的光學純度,即五種凝結芽孢桿菌的L-乳酸光學純度都達到了97%以上,ATCC7050、36D1和HL5的L-乳酸光學純度甚至達到99%以上,說明凝結芽孢桿菌主要生產L型乳酸。凝結芽孢桿菌P4-102B發酵液中殘糖的含量為15.37 g/L,但只生成了18.42 g/L的乳酸,其所消耗的葡萄糖并沒有全部轉化成乳酸,葡萄糖的消耗可能進入到其他的代謝途徑中。

表2 五種凝結芽孢桿菌發酵48 h實驗結果Table 2 Experimental results of five Bacillus coagulans strains after 48 h fermentation

2.2 凝結芽孢桿菌ATCC7050乳酸發酵過程中指標變化情況

2.2.1 凝結芽孢桿菌ATCC7050生長曲線中OD值變化 生長過程曲線如圖1所示,凝結芽孢桿菌ATCC7050由于經過了活化,其延遲期很短,凝結芽孢桿菌在復合培養基中短時間內進行快速生長,即在0～10 h處于對數生長期,在10～30 h凝結芽孢桿菌細胞因生長中不利因素的增多,其生長速度變慢達到穩定期,在30 h以后凝結芽孢桿菌細胞基本停止增長,即達到細胞的衰亡期。

圖1 凝結芽孢桿菌ATCC7050發酵中細胞生長過程Fig.1 Profiles of cell growth in Bacillus coagulans ATCC7050 fermentation

2.2.2 凝結芽孢桿菌ATCC7050發酵過程中發酵液pH的變化 從圖2可以看出,凝結芽孢桿菌ATCC7050在發酵0～5 h時發酵液的pH迅速降低,5～10 h的pH下降速度變慢,10 h之后發酵液的pH基本維持了穩定。發酵液中pH的調節主要是依靠發酵搖瓶中的碳酸鈣來調節,在發酵開始時,乳酸的合成使發酵液中懸浮起來的碳酸鈣被消耗,從而使發酵液的pH降低,隨著發酵過程的進行，搖瓶底部碳酸鈣不斷被懸浮到發酵液中,使發酵液的pH維持穩定。

圖2 凝結芽孢桿菌ATCC7050發酵中發酵液pH變化Fig.2 Change of pH in fermentation broth of Bacillus coagulans ATCC7050

2.2.3 凝結芽孢桿菌ATCC7050發酵過程中L-乳酸含量和葡萄糖含量的變化 凝結芽孢桿菌ATCC7050利用葡萄糖生產L-乳酸的發酵過程如圖3所示,在發酵開始時，乳酸的生成速率基本維持不變,隨著發酵過程到達后期(35 h以后)，凝結芽孢桿菌細胞也達到衰亡期，乳酸的生成速率明顯變緩。凝結芽孢桿菌乳酸的合成過程為葡萄糖的轉化過程,其發酵液中葡萄糖的變化過程如圖4所示,葡萄糖在發酵開始時的消耗速率較快,到發酵后期(35 h以后)葡萄的消耗速率明顯變緩,與乳酸的生成過程含量變化相反。

圖3 凝結芽孢桿菌ATCC7050 L-乳酸的生產過程Fig.3 Profiles of L-lactic acid fermentation by Bacillus coagulans ATCC7050

圖4 凝結芽孢桿菌ATCC7050 發酵液中葡萄糖的變化Fig.4 Change of glucose in fermentation broth of Bacillus coagulans ATCC7050

2.3 凝結芽孢桿菌ATCC7050乳酸脫氫酶基因的確定

根據NCBI中凝結芽孢桿菌ATCC7050全基因組信息對ldhL1、ldhL2和ldhD三個乳酸脫氫酶基因分別設計引物(LdhL1-F/LdhL1-R、LdhL2-F/LdhL2-R、LdhD-F/LdhD-R),引物序列見表1,進行PCR。PCR電泳結果如圖5所示,泳道1位ldhL1基因PCR,ldhL1基因的擴增片段大小應為1075bp;泳道2為ldhL2基因PCR,ldhL2基因的擴增片段大小應為1053bp;泳道3為ldhD基因PCR,ldhD基因的擴增片段大小應為1068bp,三個基因的PCR擴增片段大小驗證正確,說明凝結芽孢桿菌ATCC7050中存在有ldhL1、ldhL2和ldhD三個基因。

圖5 ldhL1、ldhL2、ldhD基因PCR結果Fig.5 PCR results of ldhL1,ldhL2 and ldhD genes注:M:DL5000;泳道1為ldhL1基因PCR;泳道2為ldhL2基因PCR;泳道3為ldhD基因PCR。

2.4 對ldhL1、ldhL2和ldhD三個基因轉錄情況分析

對凝結芽孢桿菌ATCC7050中ldhL1、ldhL2和ldhD三個基因進行轉錄情況分析,其電泳結果如圖6所示,ldhL1和ldhD基因分別以對數期、穩定期和衰亡期的cDNA為模板PCR擴增出正確條帶,表明ldhL1和ldhD基因在對數期、穩定期和衰亡期都有轉錄;ldhL2基因分別以對數期、穩定期和衰亡期的cDNA為模板PCR沒有擴增出條帶,表明ldhL2基因在對數期、穩定期和衰亡期未進行轉錄。

圖6 cDNA PCR結果Fig.6 Results of cDNA PCR注:M:DL500;泳道1～3、4～6、7～9分別為ldhL1基因、ldhL2基因和ldhD基因在對數期、穩定期和衰亡期的PCR結果。

對ldhL1和ldhD基因在對數期、穩定期和衰亡期細胞轉錄水平進行測定,其結果如圖7所示,ldhL1和ldhD基因的轉錄水平隨細胞生長過程逐漸降低,ldhL1基因的轉錄水平在任何細胞生長期都要高于ldhD的轉錄水平,對數期ldhL1基因的轉錄水平約為ldhD基因轉錄水平的68倍,穩定期ldhL1基因的轉錄水平約為ldhD基因轉錄水平的96倍,衰亡期ldhL1基因的轉錄水平約為ldhD基因轉錄水平的63倍。綜上結果,ldhL1基因是凝結芽孢桿菌ATCC7050 L-乳酸生產的最主要基因,可以作為對凝結芽孢桿菌研究的表型基因。

圖7 凝結芽孢桿菌ATCC7050的ldhL1(A)和ldhD(B)基因轉錄水平Fig.7 Transcriptional level of ldhL1(A)and ldhD(B) gene of Bacillus coagulans ATCC7050

3 結論

五種凝結芽孢桿菌(B.coagulans)ATCC7050、36D1、HL5、HL5-C和P4-102B主要生產L-乳酸,其光學純度在97%以上。乳酸脫氫酶是凝結芽孢桿菌乳酸生產的關鍵酶,ATCC7050菌株中與乳酸合成直接相關的基因—三種乳酸脫氫酶基因:ldhL1、ldhL2和ldhD在對數生長期、穩定期和衰亡期轉錄情況研究結果表明,ldhL1基因是凝結芽孢桿菌ATCC7050 L-乳酸合成相關的關鍵基因;ldhL2基因在菌體內并未轉錄;ldhD基因在ATCC7050中的轉錄水平較ldhL1基因轉錄水平明顯要低,在不同生長階段ldhL1基因轉錄水平是ldhD基因轉錄水平的63～96倍,這是凝結芽孢桿菌主要生產L-乳酸的重要原因。