風味蛋白酶酶解制備中國對蝦調味料風味前體物質工藝優化

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(1.浙江工商大學食品科學與生物工程學院,浙江杭州 310018; 2.浙江工商大學環境科學與工程學院,浙江杭州 310018)

作為“世界三大名蝦”之一的中國對蝦(Penaeuschinensis),又名東方對蝦,中國明對蝦。主要分布在我國黃、渤海海區,與其它種類的中國養殖蝦相比,中國對蝦分布最為廣泛,在我國水產品出口中占有重要地位[1]。中國對蝦不僅具有豐富的營養成分,而且滋味鮮美,其蛋白質成分比一般魚類肌肉、牛肉、豬肉都高,是典型的高蛋白低脂肪類的食物[2];此外,它還含有豐富的不飽和脂肪酸,約占總脂肪的66.2%[3]。中國對蝦的加工利用,主要是針對對蝦仁,因此有效的利用頭、皮、殼、尾、骨及殘余的肉等下腳料,不僅可以使資源得到最大化的利用,還能避免下腳料所引起的環境污染問題[4-5];目前,在對蝦下腳料的精加工方面,主要包括:提取蛋白質,幾丁質,蝦青素,礦物質,維生素等[6-7],還可用于生產蝦醬[8-9]、蝦黃粉、蝦的風味料[10]等方面。

在酶作用下,把蛋白質分子切割成小肽、脂肪酸、氨基酸等小分子物質,可獲得具有復雜體系的酶解液。利用蛋白酶酶解技術所獲酶解液通常富含各種游離氨基酸,可用于增加調味品香味。該方法不僅反應條件溫和,操作簡單,且能有效避免對風味前體物質的破壞。徐坤華等[11]以堿性蛋白酶水解中華管鞭蝦蝦頭制備酶解液,優化條件下,所得酶解液中游離氨基酸增加了57.49%,其中呈味氨基酸有明顯增加。李冬梅等[12]比較研究了不同蛋白酶對制備中國對蝦酶解液的影響,MRPs的感官評價顯示,復合蛋白酶制得的酶解液在鮮味、持續感和醇厚味方面均比其他蛋白酶強。此外,相關酶解技術在薩拉米、羊肉風味基料及魚肉蛋白的制備等方面也得到了廣泛應用[13-16],盡管采用單一蛋白酶酶解制備風味料有一定的功效,但是由于蛋白酶對肽鍵具有專一性,利用單一蛋白酶水解物料時,往往會對物料的酶解度產生制約作用,不利于提高酶解液的風味;采用多種蛋白酶聯合制備酶解液,因不同蛋白酶作用位點不同,所形成肽類物質的長度也存在差異,有助于形成濃郁的風味,多種蛋白酶聯合酶解工藝在玉米多肽,馬鹿茸降血糖肽以及鯽魚酶解液等[17-18]制備研究中均取得較好的效果。在蝦類酶解液制備中也有蛋白酶分步酶解[19-20]、復合酶解[21-22]相關文獻報道。

本研究首先選用六種不同蛋白酶對中國對蝦下腳料進行酶解,在總結六種酶的酶解反應特性基礎上,篩選出較好的雙酶分步酶解組合;采用響應面分析法對分步酶解工藝進行優化,并采用氨基酸含量變化及感官評定來評價酶解工藝。此酶解工藝可以為工業化大規模生產提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國對蝦下腳料 浙江省舟山市;甲醛 分析純,邁瑞化學試劑有限公司;胰蛋白酶(Trypsin) 1.5×105U·g-1食品級;中性蛋白酶(Dispase) 1.0×105U·g-1食品級;風味蛋白酶(Flavourzyme) 5.8×104U·g-1食品級;堿性蛋白酶(Alcalase) 2.8×104U·g-1食品級;木瓜蛋白酶(Papain) 2.3×104U·g-1食品級;胃蛋白酶(Pepsin) 2.9×105U·g-1食品級;均由諾維信(中國)生物技術有限公司提供。

HC700 打粉機 永康市天祺盛世工貿有限公司;Contfuge stratus高速冷凍離心機 美國Thermo公司;LGJ.15冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠;L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司;HH-2數顯電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;Delta320 DELTA320 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 中國對蝦下腳料的前處理 將中國對蝦下腳料先常溫解凍然后加入等量的水混合,再倒入膠體磨粉碎直至蝦漿中沒有大的顆粒存在(打粉機,3000 r/min,2 min),最后在將其冷凍干燥(冷凍干燥機,-40 ℃,24 h),裝入真空袋里留其備用。

1.2.2 酶的篩選 實驗中分別選取胰蛋白酶(Trypsin)、中性蛋白酶(Dispase)、風味蛋白酶(Flavourzyme)、堿性蛋白酶(Alcalase)、木瓜蛋白酶(Papain)、胃蛋白酶(Pepsin)對蝦粉進行酶解,并根據相應文獻和各種酶的最適反應條件[23],選取出本實驗中的反應條件,反應條件如下:料液比1∶9、蛋白酶用量(酶與底物質量比)2%、酶解時間3 h,初始pH和溫度根據如圖1所示的各種酶的最適pH和最適溫度來確定,在此條件下通過水解程度和感官評價等方法來比較各種蛋白酶對中國對蝦下腳料酶解的影響。

表1 各種蛋白酶的酶解反應特性Table 1 Specialties of several proteases during enzymolysis

1.2.3 復合酶組合的確定 選取上述風味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶進行組合,組合形式如下:堿性蛋白+風味蛋白、中性蛋白+風味蛋白、堿性蛋白+中性蛋白、風味蛋白+堿性蛋白、風味蛋白+中性蛋白。并對蝦粉進行酶解,酶解條件如下:料液比1∶9、蛋白酶用量(酶與底物質量比)2%、酶解時間3 h,初始pH和溫度根據如圖1所示的各種酶的最適pH和最適溫度來確定,通過比較各復合酶對蝦粉的水解度和酶解液的風味來確定本實驗的復合酶。

圖1 酶解溫度、初始pH及風味蛋白酶用量對水解度的影響Fig.1 Effect of temperature,primary pH and Flavourzyme amount on DH of Penaeus Chinensis waste

1.2.4 酶解液的制備 第一步酶解工藝確定:料水比1∶9,堿性蛋白酶用量2.4%,酶解溫度58 ℃,初始pH7.5,酶解時間3 h[23]。本文主要研究第二步酶解工藝:第一步酶解結束后進行滅酶處理(即在沸水浴中對蝦粉漿狀物水浴加熱10 min),在以風味蛋白酶繼續水解并考察其單因素。具體實驗步驟如下:稱取一定量的蝦粉,按一定料液比分散于蒸餾水中,調節初始pH,然后將樣品置于恒溫水浴鍋中,在一定溫度下加入酶進行酶解反應。恒溫反應3 h后,將酶解物置于沸水浴中滅酶10 min。水解液在3000 r/min下離心10 min,取上清液用于水解度測定(Degree of hydrolysis,DH)。

1.2.5 單因素實驗 分別以酶解液風味和水解度為指標,研究溫度、初始pH、酶用量對水解度的影響。

1.2.5.1 研究溫度對水解度的影響 分別選取40、45、50、55、60、65、70、75 ℃溫度為實驗條件,其它條件為:料液比1∶9、初始pH7、蛋白酶用量(酶與底物質量比)2%、酶解時間3 h。

1.2.5.2 研究初始pH對水解度的影響 分別選取5、5.5、6、6.5、7、7.5、8初始pH為實驗條件,其它條件為:料液比1∶9、溫度60 ℃、蛋白酶用量(酶與底物質量比)2%、酶解時間3 h。

1.2.5.3 研究酶用量對水解度的影響 分別選取0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%風味蛋白酶用量為實驗條件,其它條件為:料液比1∶9、溫度60 ℃、初始pH7、酶解時間3 h。

1.2.6 響應面試驗 在單因素實驗基礎上利用響應面分析法優化第二步酶解工藝,以水解度為指標確定最佳酶解工藝。實驗因素和水平設計如表2所示,分別以風味蛋白酶用量、初始pH和酶解溫度為參考因素,水解度為響應值,采用三因素三水平設計法確定中國對蝦下腳料最佳酶解工藝條件。

表2 實驗設計中的因素水平及編碼水平Table 2 Experimental range and factor levels for esterification process

1.2.7 水解度的計算 按國標GB/T 5009.39-2003采用甲醛電位滴定法測定酶解液中氨基態氮含量,并利用凱氏定氮法測定其中的總氮含量,以求得水解度[24-25]。

1.2.8 感官評定 將處理好的酶解產物放在65 ℃的水浴鍋中保溫,然后由20位評香人員用聞香紙蘸取酶解產物,并且將聞香紙浸入產物2～3 cm深,浸潤1 min后取出,再將聞香紙放在離鼻2～3 cm的地方吸氣,每次2～3次,評定標準見表3。

表3 蝦粉酶解液的感官評定標準Table 3 Sensory evaluation standard of shrimp powder enzymolysis solution

1.3 數據統計分析

所有實驗均為三次實驗的平均值,誤差為標準誤差;采用Origin 8.0軟件對數據進行處理和繪圖;響應面設計軟件(Version 6.0.5,Stat-Ease.Inc.,USA)對實驗過程進行分析與優化。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶種類的確定

由于蛋白酶對肽鍵的專一性,不同酶進行酶解時常具有不同的酶解性能,具體結果見表4。由表4可見,在該酶解條件下,采用胰蛋白酶酶解中國對蝦下腳料,所獲產物的蝦味較濃郁,無雜味,但是水解度相對較低;用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解時產物的蝦味一般,有雜味,不能用以改善食品的風味,不予采用;風味蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶進行酶解時,不僅水解度相對較高,且水解產物的蝦味濃郁,無雜味。因此,選取這三種水解度高、水解產物風味好的酶(風味蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶)作為研究對象,從中篩選出制備中國對蝦酶解液的最佳酶解組合。

表4 各種蛋白酶的水解度與感官評定Table 4 Hydrolysis degree and sensory evaluation of various proteases

2.2 蛋白酶復合酶解組合的確定

內肽酶進行酶解時對疏水性或堿性殘基的C末端多肽結合特異性較差,易形成小分子量的苦味肽;而外肽酶則可以有效切除此類疏水性氨基酸,使肽的苦味明顯下降,從而改善酶解產物的滋味[26]。堿性蛋白酶和中性蛋白酶是內肽酶,風味蛋白酶是內、外肽酶,為了提高蛋白質利用率并改善酶解液的苦味,實驗中選用雙酶來酶解中國對蝦下腳料,酶解效果見表5。由表可見,風味蛋白酶與堿性蛋白酶、中性蛋白酶的組合均比上述單酶水解中國對蝦下腳料時的水解度高。將風味蛋白酶應用于第二步酶解中,雖然水解度略有降低,但能減少或掩蓋內肽酶酶解所帶來的苦味[27],且酶解液蝦味醇厚,無腥味。因此,綜合各種因素,選擇堿性蛋白酶與風味蛋白酶組合作為中國對蝦下腳料分步酶解時的較佳組合。

表5 不同酶組合分步酶解中國對蝦下腳料酶解效果比較Table 5 Comparison of effects of Penaeus chinensis waste by the double-enzyme stepwise hydrolysis

2.3 風味蛋白酶酶解工藝條件優化

以風味蛋白酶作為本實驗的酶解蛋白,考察溫度、初始pH、風味蛋白酶用量對蝦粉水解率的影響,結果如圖1所示。由圖1a可知,溫度為40 ℃時,水解度最低,水解度為35%,這是由于在低溫的狀況下,酶的活性被抑制,導致水解度較低,當溫度開始逐漸升高時,水解度逐漸變大,在60 ℃時達到最高,繼續升高溫度水解度迅速降低,這是由于溫度過高導致酶失活以及被分解,從而影響酶解反應。綜合以上分析,溫度過低或過高都不利于酶解反應的進行,故選擇酶解溫度為60 ℃,此時水解度最大為53.5%。除了溫度之外,酸堿度對酶的活性也有影響。

圖1b為初始pH對水解度的影響。由圖可見,在pH5.0～8.0范圍內,pH為5時,水解度低,此時由于酸度低酶沒有失活,但酶的活性被影響了,當pH繼續變大,水解度升高,當pH達到6.5時,水解度最大,水解度為53.5%,繼續增加初始pH,水解度迅速降低,這可能是由于pH對酶的活性部位以及酶與底物結合的影響導致酶活性在pH為6.5時,水解度最大。故最適初始pH設定為6.5。

由圖1c可知,水解度隨著風味蛋白酶用量的增加而增加,當酶用量為2.0%時水解度最大,此時酶與底物之間的濃度達到飽和,繼續增加酶用量對酶水解蛋白質產生作用較小,且當酶用量達到一定值后過多酶的存在反而抑制酶的酶解活性,降低水解度,因此,2.0%作為最適酶用量。

2.4 響應面分析法優化風味蛋白酶酶解工藝條件

根據Box-Benhnken模型的中心組合試驗設計原理[28],在單因素實驗的基礎上,利用響應面設計軟件(Version 6.0.5,Stat-Ease.Inc.,USA)對中國對蝦下腳料酶解工藝進行優化。試驗方案及結果見表6,如表6所示,分別以X1、X2和X3為自變量,水解度為響應值(Y),其中實驗1～12為析因試驗,13～17為區域中心點5組重復試驗,用以估計試驗誤差。

表6 響應面試驗設計方案及實驗結果Table 6 Design and results of response surface methodology

采用Design 7.0軟件對表6中的數據進行多元回歸擬合,獲得回歸方程為:

Y=+53.52+2.10X1-2.43X2-3.76X3-2.99X12-4.12X22-6.92X32+0.70X1X2-1.16X1X3+0.15X2X3

根據方差分析表7中的分析結果可得:所有的一次項及二次項都極顯著,但是在三因素的交互作用中,X1與X2交互作用顯著,X1與X3交互作用極其顯著,X2與X3交互作用不顯著;此外,該實驗的精密度(Adeq precision)為39.35,說明該實驗不僅合理而且精確度和可信度較高。

表7 模型回歸系數顯著性檢驗和結果Table 7 Significance test and results for regression coefficients of model

響應面分析圖形是響應值與各因子所構成的一個三維空間曲面圖和等高線圖,可以從中看出各因素之間的相互影響并確定該實驗的最佳條件。在響應面圖中可以直觀地看出加酶量、初始pH、酶解溫度對水解度的影響,以及三因素間的交互關系對響應值的影響。

從圖2a和圖2d以及等高線的形狀及疏密程度可知,加酶量與初始pH交互作用顯著,且初始pH較酶用量對響應值的影響更大。同樣,在圖2b和圖2e中,當酶用量保持在較佳水平(2.0%)時,沿著酶解溫度升高方向的等高線密度更大,且水解度逐漸降低,說明與酶用量相比,酶解溫度對水解度更為敏感,且與響應值呈負相關,此外由等高線的形狀來看,兩因素交互作用極為顯著;對于圖2c和圖2f,從響應面三維圖可知,初始pH與酶解溫度間相互作用不顯著,酶解溫度比初始pH對水解度的影響更大,上述結果與表7方差分析相一致。

圖2 各因素對水解度交互作用的響應面和等高圖Fig.2 Responsive surface and contour plots for the effect of various factors on the degree of hydrolysis(DH)

通過響應面軟件分析,對風味蛋白酶二次酶解中國對蝦下腳料工藝進行了優化,結果顯示:在料水比1∶9、風味蛋白酶用量2.19%、初始pH6.36、酶解溫度58.6 ℃、酶解時間3 h條件下,中國對蝦下腳料水解度為54.88%。為了實驗操作便利,將上述最佳工藝條件進行修正:在料水比1∶9、風味蛋白酶用量2.2%、初始pH6.4、酶解溫度59 ℃、酶解時間3 h的條件下,經3次重復實驗,中國對蝦下腳料水解度為54.79%±0.34%,實驗值基本與理論預測值相一致,表明該回歸方程可靠,能夠反映上述三個因素對中國對蝦下腳料水解度的影響。

2.5 酶解前后氨基酸含量的變化

游離氨基酸是水產動物呈味的基礎物質和主要鮮味對象,結果如表8。由表8可見,雙酶分步酶解中國對蝦下腳料可以明顯的增加酶解液中氨基酸含量。酶解液中總氨基酸含量達到33.6862 mg/mL,與原料相比總氨基酸含量大大提高。其中,酶解產物中呈鮮味的氨基酸谷氨酸,賴氨酸含量分別增加了10.93及6.95 mg/mL;酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸等呈苦味的氨基酸含量雖有增加,但相對而言,呈鮮味的氨基酸含量增加幅度更大,因此對蝦下腳料經酶解后的鮮味強度得到了較大的提高。酶解液中除色氨酸之外,含有其余7種人體必需氨基酸,含量達到27.2543 mg/mL。因此雙酶分步酶解中國對蝦下腳料能明顯的提高中國對蝦下腳料酶解液的營養價值。

表8 酶解前后體系的游離氨基酸變化Table 8 Changes of free amino acids components before and after enzymatic hydrolysis

3 結論

為了獲得具有濃郁蝦風味的風味基料,提高中國對蝦的整體價值及利用率,本研究通過復合酶解工藝,即在堿性蛋白酶初步水解中國對蝦下腳料的基礎上再采用風味蛋白酶對其進行酶解;研究表明:在料水比1∶9、風味蛋白酶用量2.2%、初始pH6.4、酶解溫度59 ℃、酶解時間3 h。中國對蝦下腳料水解度為54.79%,感官評價良好。酶解液中氨基酸含量為33.6862 mg/mL,其中必需氨基酸含量為27.2543 mg/mL,其中谷氨酸與賴氨酸含量大大增加,鮮味強度得到了極大的增強,可作為蝦風味調味基料。