氣流噴爆-復合酶解對豆粕中水溶性膳食纖維的提取優化

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(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司,黑龍江佳木斯 154002)

近年來,大豆食品降低心血管病發病率、降血糖、降血脂、抗氧化等功能性得到越來越多的證實,全球范圍內宣起了消費大豆產品的熱潮[1]。豆粕是大豆油料加工過程中的副產品,每年豆粕的產量巨大[2]。因此豆粕的綜合利用已成為各國科研工作者關注的問題之一。目前,豆粕加工的一般物理方法主要有:螺桿擠壓、高壓均質及超微粉碎,但都停留在粗加工上,目前豆粕精細加工的相關研究較少[3-6]。氣流噴爆是一種新型先進的大豆深加工技術,其最大的特點是可滿足包括原顆粒物料和重組物料等多種形狀大小的物料無油、連續噴爆加工,物料受熱時間短,營養保持好,是一種應用前景廣闊的的多功能加工技術[7-8]。另外,研究發現生物酶解法處理豆粕具有條件溫和,不需要高溫、高壓等特殊條件且操作方便的特點,而本研究采用的復合酶法則能同時去除原料中的蛋白質、多糖等多種干擾成分,與單一酶解相比,復合酶解除雜更徹底[6]。如余有貴等[9]采用木瓜蛋白酶、β-淀粉酶的復合酶水解制備蕨根膳食纖維,所得產品具有較高的持水力和膨脹力。

綜上所述,本研究運用氣流噴爆聯合復合酶解技術處理生物酶法制油豆粕,提高豆粕中水溶性膳食纖維(SDF)得率,通過響應面法優化豆粕處理工藝,充分發揮氣流噴爆及復合酶解處理方法的優勢,在增大處理量并提高水溶性膳食纖維提取率的前提下,得到純度更高、性質優越穩定的豆粕水溶性膳食纖維產品,為酶法制油豆粕的開發應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 哈爾濱高科技(集團)股份有限公司;堿性蛋白酶Protex6L(8900 U/mL) 合肥泊美生物科技有限責任公司;α-淀粉酶(DA4251) 酶活≥1萬U/g,合肥泊美生物科技有限責任公司;纖維素酶 酶活≥1萬U/g,上海國藥集團化學試劑有限公司;其它試劑 均為分析純。

S22-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SWFJ超微粉碎機 廣州市旭朗機械設備有限公司;PHS-3C型雷磁pH計 上海精科;CY-大型氣流噴爆機 朝陽食品機械有限公司;TDL-408型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;Mastersizer2000激光粒度分析 英國Malvern公司;S-3400N型電子掃描顯微鏡 日本HITACHI。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆粕的制備 酶法制油豆粕的具體制備過程根據Li等[10]的方法進行,將市售大豆經粉碎機粉碎過60目篩,取200 g過篩后的粉體,按料液比為1∶6 (m/V)加入蒸餾水,攪拌均勻后放入55 ℃水浴鍋內按照酶法制油的過程進行酶解,酶解條件為:酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、pH維持在9.0、堿性蛋白酶Protex6L(8900 U/mL)添加量為0.5%,用攪拌器邊攪拌邊酶解,酶解結束后,取出并用1 mol/L HCl 溶液調節水溶液pH至7,之后100 ℃沸水滅酶5 min,將滅酶后的溶液在4500 r/min、4 ℃、20 min條件下離心,離心后將上層液體去除,僅保留下層固體豆粕,并在相同離心條件下按料液比為1∶3用去離子水將所得豆粕水洗3次后在平板鋪平后置入55 ℃鼓風烘箱干燥6 h,待恒重后研磨至顆粒均勻,即得到酶法制油豆粕,同時用于制備后續樣品A、B、C、D。

1.2.2 酶法制油豆粕的處理 樣品A、B、C、D分別為未處理豆粕、只經氣流噴爆、只經復合酶解處理及氣流噴爆聯合復合酶解處理的樣品。為避免豆粕中的脂肪氧化從而影響樣品各指標的測定,以1.2.1制備的豆粕為原料,進行脫脂處理,具體方法參照楊夢曦等[11]方法。

豆粕脫脂后經通風櫥干燥10 h后得到樣品A;將樣品A倒入氣流噴爆機內在220 ℃下噴爆30 s,然后烘干至質量恒定得到樣品B;稱取樣品B固體100 g,按料液比為1∶20 (m/V)加入去離子水攪拌30 min后,在纖維素酶∶α-淀粉酶為2∶1下酶解2 h,其中,酶制劑總添加量為3%、酶解時pH穩定在4.5±0.5,酶解溫度55 ℃,酶解結束后,沸水浴滅酶5 min,滅酶后冷卻至室溫,離心(4500 r/min,4 ℃,20 min)后沉淀烘干得到樣品D;稱取樣品A 100 g,按料液比為1∶20 (m/V)加入去離子水攪拌30 min后,在纖維素酶∶α-淀粉酶為2∶1下酶解2 h,其中,酶制劑總添加量為3%、酶解時pH穩定在4.5±0.5,酶解溫度55 ℃,酶解結束后,沸水浴滅酶5 min,滅酶后冷卻至室溫,離心(4500 r/min,4 ℃,20 min)后沉淀烘干得到樣品C。樣品A、B、C、D主要用于下述1.2.3基本成分的測定。

1.2.3 基本成分測定 樣品A、B、C、D的基本成分測定分別為:總膳食纖維(TDF)、不溶性膳食纖維(IDF)和水溶性膳食纖維(SDF)的測定采用AOAC 991.43[12]方法;蛋白質含量測定采用凱氏定氮法,參見GB5009.5-2016[13];脂肪含量測定采用索氏抽提法,參見GB.5009.6-2016[14];水分測定采用GB 5009.3-2016[15];灰分測定采用干法灰化法,參見 GB.5009.4-2016[16]。

1.2.4 單因素實驗方法 稱取一定量1.2.2中得到的脫脂豆粕,在一定氣流噴爆溫度下處理一定時間,將氣流噴爆處理后的脫脂豆粕置于干凈的燒杯中,按料液比為1∶20 (m/V)加入去離子水攪拌30 min后,在酶制劑總添加量為3%、酶解時pH穩定在4.5±0.5,酶解溫度55 ℃及一定比例的纖維素酶、α-淀粉酶下酶解一定時間,酶解結束后,沸水浴滅酶5 min,滅酶后冷卻至室溫,離心(4500 r/min,4 ℃,20 min)后將沉淀烘干用于水溶性膳食纖維得率的測定。

1.2.5 單因素實驗設計

1.2.5.1 氣流噴爆溫度的確定 設定處理的基礎條件為:酶解時料液比1∶20 (m/V)、氣流噴爆時間30 s、纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)為2∶1、酶制劑總添加量為3%、酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、酶解過程中pH維持在4.5±0.5。選取噴爆溫度為180、200、220、240、260 ℃五個水平,以水溶性膳食纖維得率(%)為指標進行單因素實驗,探討氣溫噴爆溫度對水溶性膳食纖維得率的影響。

1.2.5.2 氣流噴爆時間的確定 設定處理的基礎條件為:酶解時料液比1∶20 (m/V)、氣流噴爆溫度220 ℃、纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)為2∶1、酶制劑總添加量為3%、酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、酶解過程中pH維持在4.5±0.5。選取噴爆時間為10、20、30、40、50 s五個水平,以水溶性膳食纖維得率(%)為指標進行單因素實驗,探討氣溫噴爆時間對水溶性膳食纖維得率的影響。

1.2.5.3 纖維素酶與α-淀粉酶添加比例的確定 設定處理的基礎條件為:酶解時料液比1∶20 (m/V)、氣流噴爆時間30 s、氣流噴爆溫度220 ℃、酶制劑總添加量為3%、酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、酶解過程中pH維持在4.5±0.5。選取纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)為1∶3、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1五個水平,以水溶性膳食纖維得率(%)為指標進行單因素實驗,探討纖維素酶與α-淀粉酶添加比例對水溶性膳食纖維得率的影響。

1.2.5.4 酶解時間的確定 設定處理的基礎條件為:酶解時料液比1∶20 (m/V)、氣流噴爆時間30 s、氣流噴爆溫度220 ℃、纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)為2∶1、酶制劑總添加量為3%、酶解溫度55 ℃、酶解過程中pH維持在4.5±0.5。選取酶解時間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h五個水平,以水溶性膳食纖維得率(%)為指標進行單因素實驗,探討酶解時間對水溶性膳食纖維得率的影響。

1.2.6 響應面試驗設計 利用Design-Expert軟件對試驗進行響應面分析設計優化試驗結果,選取噴爆溫度A(℃)、噴爆時間B(min)、纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)C及酶解時間D(min)4個因素為自變量,以水溶性膳食纖維提取率R(%)為響應值,因素水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.7 水溶性膳食纖維得率測定 根據楊夢曦等[11]方法,準確稱取0.5 g樣品至于50 mL蒸餾水中,玻璃棒攪拌混勻后將樣品放入90 ℃恒溫水浴鍋中磁力連續攪拌30 min,攪拌后在3000 r/min,20 ℃條件下離心15 min,將離心后的上清液至于105 ℃烘箱烘干至恒重,最后分析天平稱取殘留物質量,按下式計算:

1.2.8 掃描電鏡觀測(SEM) 使用掃描電子顯微鏡收集氣流噴爆聯合復合酶法處理前后的豆粕(樣品A、C)掃描電子圖像。將樣品放置在具有雙面透明膠帶的樣品架上并濺射鍍金(5 min,2 mbar)。隨后,將每個樣品以20 kV的加速電壓轉移到掃描電子顯微鏡,放大3000倍。

1.3 數據處理

每組試驗都進行三次平行試驗,并將試驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對試驗數據進行方差分析、相關性和差異顯著性分析;采用Origin8.5軟件進行作圖;采用Design-Expert軟件進行響應面數據分析及方差分析。

2 結果與分析

2.1 酶法制油豆渣基本成分

表2為不同處理條件下酶法制油豆粕的基本成分占豆粕質量的百分含量。可以看出樣品A、B、C、D中水分及灰分含量基本不變,但豆粕中蛋白及脂肪含量變化較為明顯,說明氣流噴爆及復合酶解能夠有效改變豆渣蛋白及其油脂結構,從而導致豆粕中蛋白、油脂含量的變化。另外,氣流噴爆聯合復合酶解改性處理酶法制油豆粕能夠是豆渣中水溶性膳食纖維得率顯著增加,由原來的2.98%增加到26.98%,這一現象說明氣流噴爆聯合復合酶解技術能夠顯著影響提高豆渣中水溶性膳食纖維的含量,使不溶性膳食纖維水溶化,提高豆粕利用率,但具體功能特性及其蛋白結構特性有待進一步研究[17]。

表2 豆粕基本成分含量表(%)Table 2 Composition of soybean meal(%)

樣品A、B、C、D分別表示未經任何改性處理、只經氣流噴爆、只經復合酶解改性處理及氣流噴爆聯合復合酶解改性處理的豆渣樣品。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 氣流噴爆溫度的影響 根據圖1所示,隨著噴爆溫度的逐漸增加,水溶性膳食纖維得率呈現先增加后降低的變化趨勢。當噴爆溫度達到220 ℃時,水溶性膳食纖維得率最高。這種變化可能是由于在一定的噴爆溫度范圍內,物料處理后呈多孔狀態,但噴爆溫度過高時,物料發生了焦糊,導致纖維內部晶體結構改變[18]。隨著噴爆溫度的上升,物料所吸收的平均熱量升高,物料內部水分蒸發動力增強,噴爆率升高,物料內部空間變大,吸水能力變強,因此復水性也增強。綜上,噴爆溫度選擇220 ℃左右較適中。

圖1 氣流噴爆溫度對豆渣中水溶性膳食纖維得率的影響Fig.1 Effect of air explosion temperature on the yield of SDF in residue

2.2.2 噴爆時間的影響 根據圖2可以看出,隨著氣流噴爆時間的延長,水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)得率呈現先上升后下降的趨勢。水溶性膳食纖維得率在氣流噴爆30 s內逐漸增加,這可能是由于在氣流噴爆的高溫強作用力下,利用機械力克服固體內部凝聚力使纖維內部結構致密不溶性的半纖維素和不溶性果膠類化合物發生熔融現象或部分鍵斷裂,轉變為可溶性的結構疏松的半纖維素及可溶性果膠[19-21],從而使SDF得率上升。當粉碎時間達到30 s左右時SDF得率不在增加反而有下降趨勢,這可能是由于豆渣受到過度的機械力作用,使其中部分蛋白質出現變性,顆粒間聚集能力加強[22],也可能是由于隨著粉體顆粒的減小,表面積逐漸增加,表面能也隨之增加,重新聚集的可能性增強[23]。

圖2 噴爆時間對豆渣中水溶性膳食纖維得率的影響Fig.2 Effect of air explosion time on the yield of SDF in residue

上述結果表明,酶法制油豆粕氣流噴爆時間控制在30 s最為適宜,在此條件下,豆粕粉末不會出現明顯的團聚現象且水溶性膳食纖維得率最佳,這些對于豆粕在體內的消化特性極其關鍵[24-25],由于在一定受熱時間內,物料所吸收的平均熱量隨時間延長而升高,復水率增大;但當到一定程度后,過度加熱對噴爆程度影響不明顯,反而會導致物料因過度受熱而易破碎[23]。綜上,噴爆時間為30 s時,產品綜合品質較好。

2.2.3 纖維素酶與α-淀粉酶添加量比值的影響 根據圖3可以看出,當纖維素酶添加量與α-淀粉酶添加量配比為2∶1時,水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)得率達到最高,纖維素酶添加量與α-淀粉酶添加量在一定范圍下,隨著纖維素酶添加量比例的增加,水溶性膳食纖維得率增加。這可能是當底物濃度一定時,由于游離的纖維素酶越多,越容易與底物結合,然后再分解成反應產物,這樣膳食纖維水溶化程度高效增加[26],同時纖維素酶可以有效的使豆粕中的不溶性膳食纖維發生降解,分子間氫鍵斷裂、分子鏈被切斷,纖維素等不溶性多糖的結晶結構遭到破壞,使其分子量降低,溶解度發生改變,豆粕中不溶性膳食纖維經復合酶解改性處理轉變成可溶性膳食纖維,從而使水溶性膳食纖維得率增加[27]。然而,隨著纖維素酶添加量比例的繼續增加,膳食纖維被進一步降解為分子量較小的低聚糖甚至單糖,由于聚合度低而無法被乙醇沉淀,從而導致豆粕中水溶性膳食纖維得率降低[28]。因此,纖維素酶添加量與α-淀粉酶添加量配比設為2∶1。

圖3 纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)對水溶性膳食纖維得率的影響Fig.3 Effect of cellulase addition and alpha-amylase addition on the yield of SDF in residue

2.2.4 酶解時間的影響 如圖4所示,隨著酶解時間的逐漸延長,豆粕中水溶性膳食纖維呈現先上升后下降的趨勢,當酶解時間超過2 h時,水溶性膳食纖維略有下降,得率不再增加。這可能由于酶解時間較短酶與底物作用不充分導致水溶性膳食纖維得率較低,隨著酶解時間的繼續延長,酶與底物接觸越來越充分使得豆粕中水溶性膳食纖維得率逐漸增大,但是,當酶解時間達到2 h時,豆粕中水溶性膳食纖維得率下降,可能是隨著時間的逐漸延長,豆粕成分中纖維二糖、葡萄糖的生成量逐漸增多,底物濃度的不斷降低和部分酶在提取過程中的失活以及水溶性多糖的不斷積累,產物的反饋抑制效應逐漸增強,酶促反應速度逐漸降低,這對纖維素酶造成越來越強的競爭性抑制,從而使得整個反應形成明顯的反饋抑制,造成酶解效率下降,因此豆粕水溶性膳食纖維得率增加緩慢乃至降低[29-30]。因此,酶解時間應控制在2 h左右。

圖4 酶解時間對水溶性膳食纖維得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the yield of SDF in residue

2.3 響應面優化實驗結果與分析

本試驗利用統計軟件Design-Expert進行響應曲面法過程優化,選取噴爆溫度A(℃)、噴爆時間B(s)、纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)C及酶解時間D(min)4個因素為自變量,以水溶性膳食纖維提取率R(%)為響應值,根據中心組合設計原理,響應面試驗方案及結果見表3。

表3 響應面優化實驗結果Table 3 Response surface optimization experiment results

水溶性膳食纖維提取率R通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析,建立二響應面回歸模型如：

R=25.56+0.28A-0.57B-0.29C-0.74D-0.65AB+0.11AC+0.022AD-0.24BC-0.52BD+0.45CD-3.21A2-2.24B2-0.79C2-1.30D2

水溶性膳食纖維提取率R的回歸與方差分析如表4。

表4 回歸與方差分析結果Table 4 The output of CLA regression and variance analysis results

圖5 兩因素交互作用(顯著項)對水溶性膳食纖維得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface of the impact of interaction of two factor (significantly)on the rate of water-soluble dietary fiber

通過響應面尋優法確定的最優工藝條件為:噴爆溫度220.93 ℃,噴爆時間29.17 s,纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)為1.75∶1,酶解時間1.84 h,水溶性膳食纖維得率預計為25.74%,由于實驗條件等其他方面因素的限制,故最佳工藝參數設為噴爆溫度為220 ℃、噴爆時間30 s、纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)為2∶1、酶解時間2 h,進行3次平行實驗,3次平行實驗水溶性膳食纖維得率為26.03%±0.02%,說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好。

2.4 掃描電鏡觀測

如圖6所示,為不同處理條件下豆粕在掃描電鏡觀測下的結構形態。由掃描電鏡圖能夠看出豆粕處理前后發生了明顯變化,未經處理的豆粕表面光滑,粘性大,豆粕結構致密,而通過氣流噴爆聯合復合酶解處理后,豆粕表面棱角明顯,形成較多群落,顆粒間粘性顯著降低,變得疏松,棱角分明。這說明氣流噴爆聯合復合酶解處理酶法制油豆粕能夠明顯改善豆渣中膳食纖維微觀結構,提高膳食纖維的功能特性,但具體結構功能特性有待進一步研究。

圖6 不同加工條件下豆粕顯微觀測Fig.6 Microscopic observation of soybean meal under different processing conditions注:樣品(1)與(2)分別為氣流噴爆聯合復合酶解處理前后的豆粕掃描電鏡形態。

3 結論

本研究以生物酶法(酶制劑含量≤0.5%)制油豆渣為原料,采用氣流噴爆聯合復合酶解技術改性處理酶法制油豆渣,研究氣流噴爆-復合酶解處理對水溶性膳食纖維得率的影響并確定最佳加工工藝。結果表明,在氣流噴爆溫度220 ℃、氣流噴爆時間30 s、纖維素酶∶α-淀粉酶(g∶g)2∶1、酶制劑總添加量3%及酶解時間2 h條件下,水溶性膳食纖維得率最佳為26.03%±0.02%,并在掃描電鏡下觀測處理后水溶性膳食纖維形態結構更規整。因此,采用氣流噴爆-復合酶解技術處理豆渣能夠使豆渣中水溶性膳食纖維得率和加工性質均得到極大改善。