佛手黃酮提取工藝優化及其體外抗氧化活性

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(1.廣東展翠食品股份有限公司,廣東潮州 521000; 2.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylis Swingle)為蕓香科柑橘屬植物,含有檸檬油素、香豆素、黃酮和多糖等多種藥用成分[1-3],具有和胃健脾、舒肝理氣、止咳化痰、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生理功效[4-8]，是我國傳統的名貴中藥。佛手按照產地可分為廣佛手、川佛手、金佛手和建佛手[9]。廣東省佛手果種植面積大,達到2000 hm2,年產量為24000噸左右,其種植面積仍在逐年增大[10]。目前多以鮮果和盆景銷售為主、佛手涼果蜜餞等粗加工產品為輔。隨著天然提取物研究熱度的提高,利用佛手來提取天然活性物是很有前景的。

黃酮類化合物是佛手的主要活性成分之一,其中主要含香葉木甙、橙皮苷、3,5,6-三羥基-4′,7-二甲氧基黃酮、3,5,6-三羥基-3′,4′,7-二甲氧基黃酮等[11]。目前關于佛手黃酮提取方法有:表面活性劑SDS輔助微波提取、微波和超聲波聯合提取、超聲提取以及浸提法等。而在這些提取過程中萃取劑選擇的為含水乙醇[12-15]。但是在眾多提取方法中鮮見采用乙醇回流法來提取佛手黃酮,采用乙醇回流法提取佛手黃酮,在整個工程中減少乙醇的損失,使料液比維持在一個相對穩定的狀態中。

基于以上分析,本文在單因素實驗的基礎上,采用(Box-Behnken)中心組合設計原理,以佛手黃酮的得率(Y)為響應值,優化提取工藝，然后以DPPH和ABTS 自由基以及ORAC(總抗氧化能力)清除率來評價佛手黃酮的抗氧化活性,這對開發天然抗氧性化合物,綜合利用佛手資源,提高佛手的附加值具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣佛手干片 廣東展翠食品有限公司提供;橙皮苷標準品 Sigma公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Westgene公司;2,2-連氨基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、AAPH、Trolox Aladdin公司。

UV-3010型紫外分光光度計 日本日立高科技公司;DF-101S型數顯電熱恒溫水浴鍋 鞏義予華儀器有限公司;AL104型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Enspire 2003型多功能酶標儀 美國PE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 佛手黃酮的提取 取一定量的佛手干片粉碎并過30目篩,經低溫連續相變萃取裝置提油后[16],準確稱取一定量的去油渣粉末若干,加入一定量不同體積分數的乙醇溶液,分別在不同回流溫度、不同回流時間以及不同的料液比條件下進行回流提取,再通過抽濾后,去上清液即為黃酮粗提液。

1.2.2 單因素實驗 采用1.2.1中黃酮提取方法進行,提取條件為乙醇濃度75%、回流溫度80 ℃、回流時間90 min、料液比1∶30 g/mL為固定水平,各考察因素水平為乙醇濃度65%、75%、85%、95%,回流溫度60、70、80、90 ℃,回流時間30、60、90、120 min,料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL。考察各單因素對佛手黃酮得率的影響,每組實驗重復3次。

1.2.3 響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上,選取乙醇濃度(A)、回流時間(B)和料液比(C)3個因素為自變量,由于提取溫度變化不顯著,設定為80 ℃,根據Box-Behnken中心組合設計原理,以佛手黃酮得率(Y)為響應值。因素水平編碼見表1。

表1 中心組合實驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.2.4 佛手黃酮得率的測定 參考農業標準(NYT 2010-2011 柑桔類水果及制品中總黃酮含量的測定)進行黃酮含量的測定[17]。得到橙皮苷的標準曲線方程為A=0.006C-0.0002,相關系數r=0.9999,線性范圍在0～100 mg/mL,計算佛手黃酮的得率[18-19]。

黃酮得率(%)=m0/m×100

m0=ρ×V×f

其中：m0為粗提液中黃酮的含量,單位為g;m為樣品的重量,單位為g;ρ為標曲中橙皮苷的質量濃度,單位為mg/L;V為樣品總體積,單位為L;f為測定時樣液的稀釋倍數。

1.2.5 佛手黃酮體外抗氧化活性研究

DPPH自由基清除率(%)=[1-(At-Ar)/A0]×100

ABTS自由基清除率(%)=[1-(At-Ar)/A0]×100

1.2.5.3 總抗氧化能力指數(ORAC)的測定 將樣品稀釋1000倍后測試,結果以水溶性維生素E類似物trolox的濃度μmol/L來表示,即將樣品Net AUC代入trolox的線性方程中進行計算,得出樣品的ORAC值[22]。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0進行單因素方差分析、Origin 8.5軟件作圖、Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計和統計學分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對佛手黃酮得率的影響 由圖1可知,乙醇濃度從65%增大到75%時,黃酮得率逐漸顯著增加(p<0.05),此時黃酮得率最高為1.26%;隨著乙醇濃度的進一步增大,黃酮得率出現顯著下降趨勢(p<0.05)。由于黃酮類化合物在植物體內多以糖苷的形式存在,糖苷具有一定的親水作用,而黃酮具有一定的疏水作用,因此乙醇濃度與黃酮類化合物的分離效果并不呈正相關關系;另一方面,利用乙醇提取植物中的總黃酮時,如果乙醇濃度過大,會將部分脂溶性物質提取出來[23]。因此,乙醇與水達到一定比例時,黃酮得率才會最高,最佳乙醇濃度為75%。

圖1 乙醇濃度對佛手黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids

2.1.2 提取溫度對佛手黃酮得率的影響 由圖2可知,提取溫度從60 ℃增大到80 ℃時,黃酮得率逐漸顯著增加(p<0.05),此時黃酮得率最高為1.26%;隨著溫度的進一步升高,黃酮得率變化不明顯(p>0.05)。這是因為溫度升高會造成黃酮氧化加速;另一方面可能是因為高溫會對黃酮物質的活性造成破壞,使得雜質溶出增多。因此,最佳提取溫度為80 ℃。

圖2 提取溫度對佛手黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction yield of flavonoids

2.1.3 提取時間對佛手黃酮得率的影響 由圖3可知,提取時間從30 min增大到90 min時,黃酮得率逐漸顯著增加(p<0.05),此時黃酮得率為1.37%;隨著溫度的進一步升高,黃酮得率出現顯著下降趨勢(p<0.05)。這是因為黃酮提取液暴露在空氣中時間長易氧化;另一方面是隨著時間的增加佛手中的雜質會與有效成分競爭溶劑[23]。因此,最佳提取時間為90 min。

圖3 提取時間對佛手黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of flavonoids

2.1.4 料液比對佛手黃酮得率的影響 由圖4可知,料液比從1∶20 g/mL增加到1∶30 g/mL時,黃酮得率逐漸顯著增加(p<0.05),此時黃酮得率為1.37%。隨著料液比的進一步增加,黃酮得率出現顯著下降趨勢(p<0.05)。這是因為在料液比較小時,有效成分尚未完全溶出,而隨著料液比的增大,佛手中的雜質會與有效成分相互競爭溶劑而導致得率又降低[24]。因此,最佳提取料液比為1∶30 g/mL。

圖4 料液比對佛手黃酮得率的影響Fig.4 Effect of different liquid on extraction yield of flavonoids

2.2 響應面實驗結果分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 單因素實驗結果表明,乙醇濃度、提取時間、料液比是影響得率的三個最主要的因素,由于提取溫度變化不顯著,則設定為80 ℃,根據Box-Behnken中心組合設計原理,以佛手黃酮得率(Y)為響應值,進行響應面試驗及結果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken experimental design arrangment and results

試驗結果采用Design-Expert V8.0.6.1軟件對表2中的17個試驗點的響應值進行多元回歸擬合后得到黃酮得率與各因素的二次多項回歸方程模型R:

Y(%)=1.35-0.051A+3.75 B+0.03C+AB+0.032AC+0.013BC-0.11A2-0.093B2-0.12C2

由表3分析結果可知,表中F值越大表明該因素對黃酮得率影響越大,各因素對黃酮得率的影響大小依次為:乙醇濃度(A)、料液比(C)、提取時間(B)。在此模型中A、A2、B2和C2是極顯著性因子項(p<0.01),而B、AB、AC、BC無顯著性差異(p>0.05),說明乙醇濃度、提取時間、料液比兩兩間沒有交互作用。通過對數據進行分析后,剔除不顯著的項,分別簡化了黃酮得率(Y)乙醇濃度(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)的二次多項式回歸方程為:

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

Y(%)=1.35-0.051A+0.03C-0.11A2-0.093B2-0.12C2

由表3可以看出,佛手黃酮得率模型的p<0.01,表明該模型因子具有極顯著性意義;該模型的失擬項的p>0.05,無顯著性差異,說明所得方程與實際擬合中非正常所占比例小,這種試驗方法是可靠的,模型能夠很好的推測試驗結果;佛手黃酮得率模型的決定系數R2=0.9696,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小;校正擬合度為0.9306,說明模型可以解釋93.06%響應值的變化,可以用該回歸方程模型來解釋設計方案。

2.2.2 響應面交互作用分析與優化 為了讓各因素及之間相互作用可以有效直觀的反映,以佛手黃酮的得率為響應值,分別使模型中的提取溫度(A)、提取時間(B)和料液比(C)中的一個因素固定在中間的水平上,以此得到另外兩個因素交互作用對乙醇回流法提取的佛手黃酮模型,并根據該模型繪制三維曲面圖與等高線圖。圖5～圖7分別表示3組以黃酮得率為響應值的趨勢變化圖。從等高線圖可以明顯的看出兩個變量間交互作用的顯著程度,其中圓形表示兩個因素之間交互作用不顯著(p>0.05),而橢圓形則表示兩個因素之間交互作用顯著(p<0.05)[25]。

圖5 乙醇濃度與回流時間的交互作用Fig.5 Response surface plots of ethanol concentration and extracted time

圖6 乙醇濃度與液料比的交互作用Fig.6 Response surface plots of ethanol concentration and liquid to material ratio

圖7 回流時間與液料比的交互作用Fig.7 Response surface plots of extracted time and liquid to material ratio

2.2.3 驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件求解方程,系統預測得出佛手黃酮得率的最佳工藝條件為:乙醇濃度72.79%,提取時間90.47 min,料液比1∶31 (g/mL),在此條件下,模型預測得到黃酮得率為1.359%。

為了檢驗響應面優化試驗所得到結果的可靠性,對乙醇回流法提取黃酮的工藝優化條件進行驗證。考慮到實際操作因素,將上述條件修正為:乙醇濃度為73%,提取溫度80 ℃,提取時間90 min,料液比為1∶31 (g/mL),在此條件下黃酮得率為1.34%。佛手黃酮得率實際值與預測理論值未發現顯著性差異,證明運用試驗建立的數學模型進行預測在實踐中是切實可行的,適用于工業生產。

2.3 佛手黃酮體外抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖8可知,佛手黃酮對DPPH自由基的清除率隨著黃酮濃度的增加而在增大,而且佛手黃酮提取物清除DPPH自由基能力弱于VC和VE,這可能是因為黃酮提取物為混合物,純度低,雜質較多,抑制了其抗氧化活性。其中DPPH自由基清除率的IC50為0.8 mg/mL,強于辣木葉黃酮提取物[25],表明佛手黃酮具有較好的清除DPPH自由基的能力。

圖8 黃酮濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Effect of flavonoid concentration DPPH radical-scavenging activity

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由圖9可知,佛手黃酮對ABTS自由基的清除率隨著黃酮濃度的增加而在增大,雖然佛手黃酮提取物清除ABTS自由基能力弱于VC,但是在濃度為0～0.08 mg/mL范圍內,佛手黃酮提取物清除ABTS自由基能力強于VE。而且佛手黃酮提取物在濃度為0.04 mg/mL時清除ABTS自由基能力大于50%,并且強于王玉茹等[26]乙醇提取的山楂黃酮提取物,可見其仍表現出較強的清除ABTS自由基效果。

圖9 黃酮濃度對ABTS自由基清除率的影響Fig.9 Effect of flavonoid concentration ABTS radical-scavenging activity

2.3.3 總抗氧化能力(ORAC) ORAC法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基的來源,Sodium Fluorescein為熒光劑,水溶性維生素E類似物Trolox做為定量標準[27]。由圖10可知Trolox 系列標準溶液標準曲線方程為Y=0.509X+30.288,決定系數R2=0.9047。試驗結果表明,在此條件下黃酮樣品為20.18 μmol TE/g,表明佛手黃酮具有較好抗氧化能力。

圖10 Trolox的標準曲線Fig.10 Standard curve of Trolox

3 結論

采用乙醇回流法提取去精油后的佛手黃酮,通過單因素與響應面實驗,建立了佛手黃酮得率的回歸模型。該模型測得出佛手黃酮得率的最佳工藝條件為:乙醇濃度73%,提取溫度80 ℃,提取時間90 min,料液比1∶31 g/mL,在此條件下,黃酮得率為1.34%。體外抗氧化實驗表明,佛手黃酮對DPPH、ABTS具有一定的清除能力,其中對ABTS自由基清除能力明顯,此外佛手黃酮的總抗氧化能力為20.18 μmol TE/g,說明佛手黃酮具有較好的抗氧化活性。該實驗結果為開發新型的佛手黃酮保健品奠定了基礎的理論依據。