響應(yīng)面法優(yōu)化酸棗仁多糖的脫色工藝

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(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134; 2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

酸棗仁是鼠李科植物酸棗(ZiziphousjujubaMill.Var.Spinosa(Bunge)Hu.Et H.f.Chou)的干燥成熟種子,具有鎮(zhèn)靜催眠,補(bǔ)肝寧心等功效[1-2],臨床上常用于治療體虛多汗、虛煩不眠、津傷口渴、驚悸多夢等癥[3-5]。酸棗仁在我國西北、東北及華北地區(qū)常見分布。酸棗仁中含有皂苷及三萜、黃酮、生物堿、脂肪酸和多糖等成分,但是目前關(guān)于酸棗仁的研究大都集中在黃酮、皂苷等化合物的研究[6],而關(guān)于多糖的研究報(bào)道少見。

目前關(guān)于植物多糖的相關(guān)研究越來越多,并且已有研究表明植物多糖在抗腫瘤、抗肝炎、調(diào)節(jié)糖代謝等方面表現(xiàn)出顯著的生物活性,且毒副作用低,已經(jīng)成為近年來藥品、保健食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[7],而酸棗仁多糖具有較好的體液、細(xì)胞免疫功能,因此具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[8]。植物多糖多具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu),由多個單糖通過糖苷鍵連接聚合,分子量高,利用傳統(tǒng)工藝提取的粗多糖通常顏色較深,純度不高,不利于產(chǎn)品的進(jìn)一步研究利用[9]。多糖的脫色處理應(yīng)用較多的是大孔吸附樹脂、纖維素吸附以及雙氧水脫色等方法。其中,大孔樹脂法具有操作簡便、處理量大等諸多優(yōu)點(diǎn),被越來越多的應(yīng)用于脫色工藝研究中[10-12]。

本文利用大孔樹脂研究酸棗仁多糖的脫色工藝,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對酸棗仁多糖脫色工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,通過方程擬合優(yōu)化最優(yōu)脫色工藝,為深入開發(fā)利用該多糖資源奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁 產(chǎn)自天津薊縣;D101、ADS-7、D3520大孔樹脂 天津南大樹脂科技有限公司;95%乙醇、硫酸、葡萄糖等試劑 均為分析純;水 為去離子水。

UV-2550型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津;TDA-8002型恒溫水浴鍋 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;KQ-500B型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;V-700型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;TS-100型數(shù)顯脫色搖床 上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FA1004型(Max 100 g)型電子天平 上海精科天平有限公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁粗多糖的提取 酸棗仁粗多糖參考黃小娟等[13]的水提醇沉的提取方法提取,粉末狀干品。稱取多糖干品于適量去離子水中,超聲輔助溶解,離心(4000 r/min,5 min),取上清,備用。

1.2.2 樹脂的篩選 分別量取75 mL預(yù)處理樹脂(D101、ADS-7、D3520)于250 mL錐形瓶中,每瓶加入50 mL質(zhì)量濃度為3 mg/mL的待處理樣品,置于搖床上緩慢搖晃(60 r/min)吸附3 h,過濾,測定濾液多糖脫色率和多糖保留率,據(jù)此選擇所用樹脂型號。

1.2.3 樹脂再生后對多糖脫色率和多糖保留率的影響 樹脂解吸附后,向盛有大孔吸附樹脂的錐形瓶中加4%的HCl高于樹脂層面10 cm,浸泡4 h。然后6倍量的相同濃度溶液進(jìn)行洗滌,隨后水洗至流出液pH約為7,隨后用4%的NaOH同上處理,最后再用純水洗至流出液pH約為7。樹脂再生處理后,通過測定前后純水洗滌液的吸光度值進(jìn)而評價其再生前后對多糖脫色率和多糖保留率的影響,評價其再生能力。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn),將上樣質(zhì)量濃度、上樣量和洗脫流速三個因素分別對D101大孔吸附樹脂對多糖脫色的影響進(jìn)行考察分析。

1.2.4.1 上樣質(zhì)量濃度對多糖脫色的影響 將經(jīng)過前處理的D101樹脂50 mL,裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),采用濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的樣品上樣,上樣量及洗脫流速分別為3.5 mL及3 BV/h,超純水洗脫3 BV(1 BV=30 mL),研究上樣質(zhì)量濃度對多糖保留率和多糖脫色率的影響。

1.2.4.2 上樣量對多糖脫色的影響 將經(jīng)過前處理的D101樹脂50 mL,裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),分別以2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL五個不同體積的上樣量進(jìn)行上樣,固定上樣濃度為3 mg/mL,洗脫流速為3 BV/h(1 BV=30 mL),超純水洗脫3 BV(1 BV=30 mL),研究上樣量對多糖保留率和多糖脫色率的影響。

1.2.4.3 洗脫流速對多糖脫色的影響 將經(jīng)過前處理的D101樹脂50 mL,裝柱(2.0 cm×25 cm玻璃層析柱),分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行洗脫,上樣量為3.5 mL,樣品濃度3 mg/mL,超純水洗脫3 BV(1 BV=30 mL),研究洗脫流速對多糖保留率和多糖脫色率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn),選擇上樣質(zhì)量濃度(X1)、上樣量(X2)、洗脫流速(X3)為考察因素,以多糖脫色率和多糖保留率二者綜合考慮的歸一值(OD)作為試驗(yàn)考察的響應(yīng)值。經(jīng)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析,用Design-Expert 8.0.6軟件,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),篩選出最高響應(yīng)值以便找出多糖的最佳脫色工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素水平編碼Table 1 Factors and levels coding of response surface design

1.2.6 多糖保留率測定

1.2.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取一定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品加適量水溶解并混勻。分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于不同試管中,均加去離子水至2.0 mL,每管加6.0 mL硫酸-蒽酮溶液,混勻,靜置15 min,冷卻。在625 nm處測量其A值并以去離子水作空白。以葡萄糖的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),其A值為縱坐標(biāo),得:C=31.6A+0.0572,相關(guān)性系數(shù)R2=0.9991。

1.2.6.2 多糖保留率測定及計(jì)算方法 硫酸-蒽酮法用于測定樣品中的糖含量(以葡萄糖計(jì))[15]。利用紫外分光光度計(jì)測量溶液的A值,將測量所得的A值代入上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算其多糖含量。

式中,Y2為多糖保留率,C1為脫色前多糖含量,C2為脫色后多糖含量。

1.2.7 多糖脫色率的測定 待測品進(jìn)行紫外全掃描后,確定色素的主要吸收峰在450 nm附近。選擇450 nm波長為檢測波長,測定單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)中各溶液的吸光度,平行測定3次,測定溶液的吸光度。計(jì)算公式如下[16]:

式中,Y1為多糖脫色率,A1為脫色前多糖溶液吸光度,A2為脫色后多糖溶液吸光度。

1.2.8 歸一值OD的計(jì)算 以各指標(biāo)的最佳測定值為滿分,然后根據(jù)正比和反比關(guān)系將各值換成對應(yīng)的百分比,以多糖脫色率和多糖保留率為考察指標(biāo),根據(jù)各指標(biāo)的重要程度,確定其權(quán)重系數(shù)[14],按照綜合評判公式:歸一值OD=Mα/Y1+Nβ/Y2,其中,M、N分別為Y1(多糖脫色率)和Y2(多糖保留率)的權(quán)重系數(shù),M、N的值分別為0.5、0.5,α為20個Y1中最小值,β是20個Y2中最小值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用“平均值±SD”表示,圖像采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析處理;采用Design-Expert 8.0.6軟件建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的篩選

在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的基礎(chǔ)上選取D101、D3520、ADS-7 3種不同型號的大孔樹脂的以多糖脫色率和多糖保留率值為考察對象進(jìn)行樹脂類型的篩選。結(jié)果如表2所示,D101脫色率(49.61%)只比D3520脫色率(52.64%)稍低,但保留率(75.78%)最高,而ADS-7樹脂的多糖脫色率(47.13%)及多糖保留率(52.40%)均低于D101及D3520的多糖脫色率和多糖保留率值。因此,考慮到多糖脫色工藝的效率及資源的節(jié)約,選擇D101對樣品脫色處理。

表2 3種樹脂對酸棗仁多糖的脫色率與多糖保留率影響Table 2 Effects of 3 resins on the decolorization and retention rate of ZSS polysaccharide

不同型號的樹脂的吸附能力對樣品脫色工藝具有較大的影響,極性及空間結(jié)構(gòu)(孔徑、比表面積等)對其吸附能力具有決定作用。由表2知,D101和D3520為非極性大孔樹脂,而ADS-7是極性樹脂。D101的平均孔徑(25～28 ?)小于D3520(85～90 ?),比表面積(≥550 m2/g)和D3520(480～520 m2/g),所以二者對小分子樣品的吸附能力相差不大。多糖一般都是具有較大分子量的物質(zhì),其純化是去除色素等小分子的雜質(zhì),由表2可看出，D101樹脂的脫色率及保留率均高于ADS-7樹脂；與D3520樹脂的多糖脫色率及多糖保留率相比，D101樹脂也明顯高于D3520樹脂的多糖保留率，而多糖脫色率稍低于D3520樹脂的多糖脫色率。綜合分析，D101樹脂更合適用于樹脂的脫色，因此將D101用于脫色工藝。

2.2 D101大孔吸附樹脂再生后脫色的結(jié)果

D101大孔吸附樹脂再生后脫色的結(jié)果如表3所示,從3表可看出,D101樹脂經(jīng)過再生后對多糖脫色效果略有下降。

表3 D101大孔吸附樹脂新生及再生后對多糖脫色和多糖保留率效果Table 3 Effects of generation and regeneration of D101 macroporous adsorption resin on the decolorization and retention rate of polysaccharide macroporous resin

樹脂使用多次后,其表面及內(nèi)部會吸附許多雜質(zhì),使樹脂的表面發(fā)生顏色變化,純化能力下降,因而要對其再生處理。表3表明,在相同條件下,由于大孔吸附樹脂使用過后會產(chǎn)生部分死體積而造成多糖保留率略有下降,但是多次使用以后多糖保留率略有升高,脫色能力下降。可能原因?yàn)闃渲?jīng)過多次試用而產(chǎn)生死體積使其脫色能力下降,吸附能力下降進(jìn)而導(dǎo)致多糖保留率的升高[17]。因此,該樹脂具有一定的再生價值。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 上樣質(zhì)量濃度對多糖脫色率及多糖保留率的影響 由圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在1～5 mg/mL的上樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著上樣質(zhì)量濃度的增加多糖的保留率表現(xiàn)出增加的趨勢,但是在大于3 mg/mL時這種增長趨勢變緩。然而樣品的脫色率隨著上樣質(zhì)量濃度的增加表現(xiàn)出明顯的下降趨勢,當(dāng)濃度大于3 mg/mL時這種下降趨勢更為明顯,這可能是由于色素的吸附使樹脂的接觸面飽和而使其吸附能力下降有關(guān)[17]。本試驗(yàn)在上樣質(zhì)量濃度對多糖脫色效果的考察中,綜合考慮對多糖脫色率及多糖保留率的影響,選擇3 mg/mL為多糖脫色工藝的上樣質(zhì)量濃度。

圖1 上樣質(zhì)量濃度對多糖脫色率和多糖保留率的影響Fig.1 Effect of sample concentration on decolorization and retention rate of polysaccharides

2.3.2 上樣量對多糖脫色率及保留率的影響 由圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在2.5～4.5 mL的上樣量范圍內(nèi),固定一定的洗脫流速及上樣質(zhì)量濃度,多糖保留率隨著上樣量的增加而增加,但是在大于3.5 mL時這種增長趨勢變緩。在相同的條件下,多糖的脫色率表現(xiàn)出明顯的相反趨勢,說明樹脂對色素的吸附在一定范圍達(dá)到飽和,樹脂的脫色率下降。本試驗(yàn)在上樣量對多糖脫色效果的考察中,綜合考慮對多糖脫色率和多糖保留率影響后,以3.5 mL為樣品較適宜的上樣量。

2.3.3 洗脫流速對多糖脫色率及保留率的影響 由圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,在1.0～5.0 BV/h的洗脫流速范圍內(nèi)，多糖的保留率隨著洗脫流速的增加而增加,主要原因是隨著洗脫流速的增加多糖與樹脂的接觸時間縮短,當(dāng)上樣完成進(jìn)行洗脫時多糖更快的流出色譜柱,減少了多糖在樹脂中的吸附損耗因而使其保留率增加;但是在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,多糖脫色率表現(xiàn)出明顯的降低趨勢,主要可能原因是過快的流速減少了多糖溶液與樹脂的接觸時間,因而降低了樹脂的吸附能力[18],降低了脫色的效率。本試驗(yàn)在洗脫流速對多糖脫色效果的考察中,相同實(shí)驗(yàn)條件下隨著洗脫流速的增加多糖脫色率減少但多糖保留率增加,綜合考慮對多糖脫色率和多糖保留率影響后,以3 BV/h為樣品較適宜的洗脫流速。

圖3 洗脫流速對脫色率及多糖保留率的影響Fig.3 Effects of elution velocity on decolorization and retention rate of polysaccharide

2.4 酸棗仁多糖脫色工藝響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表3中的因素與水平值,按照Box-Behnken設(shè)計(jì),共17個試驗(yàn)點(diǎn),其中13組為析因點(diǎn),4組為零點(diǎn),每組進(jìn)行平行試驗(yàn)。其試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface test

2.5 擬合模型的建立與數(shù)據(jù)分析

以Design-Expert 8.0.6分析對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,建立二次回歸模型,確定以多糖脫色率和多糖保留率的歸一值(OD)為優(yōu)化指標(biāo),由此得出酸棗仁多糖脫色工藝的二次多項(xiàng)回歸方程:

由表5可知,模型p<0.01,因此認(rèn)為此模型具有極顯著性。該回歸方程的模型擬合度具有顯著水平,模型相關(guān)系數(shù)(R2=0.9963)較高,失擬項(xiàng)顯示不顯著,表明模型擬合程度好,試驗(yàn)誤差小,因此模型可用于預(yù)測本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.5.1 兩因素交互效應(yīng)分析 以Design-Expert V8.0.6的三維響應(yīng)面來找出最佳優(yōu)化工藝,通過確定3個影響因素之一為中值,將中值代入回歸模型方程得新方程,根據(jù)新的模型方程得到三維響應(yīng)面圖和等高線圖,并從中確定OD最優(yōu)條件,結(jié)果如圖5。

根據(jù)響應(yīng)面的設(shè)計(jì)原理,響應(yīng)面的圖越彎曲,兩個因素間作用越顯著,由此可體現(xiàn)出各因素間交互作用對OD的影響大小。比較圖4中3組圖可知,X1和X2兩兩之間交互作用對OD影響顯著(p<0.05),上X1和X3、X2和X3水平之間交互作用對OD影響不顯著(p>0.05)。

圖4 各因素交互作用對酸棗仁多糖脫色工藝影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graph interaction factors of the ZSS polysaccharide decolorization process

2.5.2 最佳工藝條件驗(yàn)證 根據(jù)OD值的計(jì)算方式[19],得到OD值的理論最低值為0.55，在此條件下找到實(shí)際自變量的范圍，具體為：上樣濃度為2 mg/mL,上樣量為3.5 mL,洗脫速度為4 BV/h。根據(jù)最佳優(yōu)化條件,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)測得多糖脫色率均值為61.32%,多糖保留率均值為87.05%,其OD值為0.56。預(yù)測值為0.55,預(yù)測值與實(shí)際測得值相比,其相對誤差較小,說明本試驗(yàn)的模型可較好的預(yù)測各因素與效應(yīng)面之間的變化關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì),利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化酸棗仁多糖脫色工藝。各因素對酸棗仁多糖脫色率和多糖保留率的影響大小為:洗脫速度(X3)>上樣質(zhì)量濃度(X1)>上樣量(X2)。由回歸分析結(jié)果表明酸棗仁多糖的最優(yōu)脫色工藝為:上樣質(zhì)量濃度2 mg/mL,上樣量3.5 mL,洗脫流速4 BV/h,并進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),測得的多糖脫色率和多糖保留率的平均值分別為61.32%和87.05%,其OD值為0.56。結(jié)果與模型預(yù)測值偏差較小,則本次實(shí)驗(yàn)所得模型能用于預(yù)測各因素與效應(yīng)面之間的變化關(guān)系。