脫支秈米淀粉包合三種風味物質的研究

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(安徽農業大學茶與食品科技學院,安徽合肥 230036)

風味成分是現代食品工業中不可或缺的重要組成部分,但由于其易揮發不穩定,限制了其應用發展。芳樟醇、庚醇和薄荷醇是三種典型的弱極性小分子風味物質,常在食品加工中使用[1-2]。淀粉因其價格低廉,能形成相對穩定的空間網絡結構常作為壁材被廣泛應用于風味物質的包合中[3]。秈稻在我國南部地區種植廣泛,曾作為南方的主要口糧,但秈米飯口感差,隨著人們生活品質的提高,秈米在食用大米市場占有率日趨降低,更多的利用價值亟待開發[4]。

淀粉作為壁材包合風味物質一直是熱門研究方向,但對于優化淀粉包合能力的研究鮮有報道。秈米淀粉作為包合壁材包合小分子風味物質的研究已有報道,但相對其他壁材種類,存在著包合率偏低的問題[5-6]。

直鏈淀粉分子易形成外親水內疏水的螺旋空腔結構,因而高直鏈淀粉對風味物質的包合效率高,更容易保持揮發性的風味成分[7]。本實驗采用異淀粉酶脫支糊化后的秈米淀粉,得到一定程度水解的同時提高秈米淀粉中直鏈淀粉分子的含量。以包合率作為標準,通過單因素和正交試驗優化酶解參數,得到更適合芳樟醇、庚醇、薄荷醇的秈米淀粉包合材料,為秈米淀粉作為其他風味成分的包合壁材提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秈米淀粉 直鏈淀粉含量17.1%，合肥市金玉超食品有限責任公司,市售;異淀粉酶(115 U/mg)、芳樟醇、庚醇、薄荷醇 西格瑪奧德里奇公司,分析純;無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等其他化學試劑 國藥集團化學試劑有限公司,分析純 。

DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;KQ-250DE型數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;FD-1A-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;7890A氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;IS50傅立葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司;S-4800掃描電鏡 日本日立公司;Q500熱重分析儀 美國TA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫支淀粉的制備 稱取一定量秈米淀粉置于10 mL pH5.8磷酸緩沖液的20 mL具塞試管中,振蕩均勻,沸水浴10 min,完全糊化后取出冷卻至50 ℃,根據底物質量加入一定比濃度異淀粉酶溶液(115 U/mg)1 mL,振蕩均勻后50 ℃水浴反應一定時間,結束脫支后將試管置于沸水浴中5 min,滅活異淀粉酶,系統冷卻至室溫后轉移至20 mL離心管,然后在-4 ℃,4500 r/min條件下離心10 min。取沉淀去蛋白處理后用離子水清洗。冷凍干燥后封裝,低溫干燥條件下保存待用。

1.2.2 單因素實驗 采用單因素實驗研究脫支過程中的脫支時間、酶濃度以及底物濃度對包合率的影響。研究脫支時間對包合率的影響時,酶濃度固定在30 mg/g,底物濃度固定在0.03 g/mL,脫支時間參數水平分別為10、20、30、40、50 min;研究酶濃度對包合率的影響時,脫支時間固定在30 min,底物濃度固定在0.03 g/mL,酶濃度參數水平分別為10、20、30、40、50 mg/g;研究底物濃度對包合率的影響時,脫支時間固定在30 min,酶濃度固定在30 mg/g,底物濃度參數水平分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL。

1.2.3 正交試驗 根據單因素實驗結果,取每個因素最佳水平的前后兩個水平進行三因素三水平的正交試驗。實驗設計如表1～表3所示。

表1 芳樟醇包合壁材正交試驗設計表Table 1 Orthogonal experimental design of linalool-wall material

表2 庚醇包合壁材正交試驗設計表Table 2 Orthogonal experimental design of heptanoll-wall material

表3 薄荷醇包合壁材正交試驗設計表Table 3 Orthogonal experimental design of menthol-wall material

1.2.4 包合壁材的基本性質測定 根據正交試驗優化后的脫支工藝參數制備脫支淀粉,測定其基本性質,采用雙波長比色法[8]測定直鏈淀粉含量,采用DNS比色法測定水解度,溶解度的測定參考Yang的方法[9]。

1.2.5 包合物的制備 采用超聲波輔助共沉淀法[10-11],稱取0.2 g壁材于盛有10 mL蒸餾水的20 mL具塞試管中。沸水浴60 min后冷卻至50 ℃,渦旋振蕩1 min,加入20 μL芳樟醇或庚醇或薄荷醇,封口密封后渦旋振蕩1 min。將試管置于50 ℃超聲波清洗機中處理30 min。冷卻至室溫,將反應系統置于4 ℃冰箱中保存12 h后轉移至培養皿中,保鮮膜密封于-18 ℃條件下保存24 h。取出后在保鮮膜上扎孔若干,冷凍干燥24 h得到固體包合物。將包合物置于盛有P205的干燥器中2 h以消除可能殘留的水分,儲存于密封瓶置于4 ℃冰箱中。

1.2.6 包合物中風味物質含量的測定 采用氣相色譜的方法[12-13]。取60 mg待測包合物樣品于盛有7 mL無水乙醇的50 mL離心管中,旋緊管蓋后用封口膜密封,渦旋至均勻狀態。將離心管置于超聲波清洗器中,40 ℃條件下作用30 min,使風味物質充分被提取至溶劑層中,冷卻至室溫后6000 r/min,4 ℃條件下離心10 min。取上清液使用氣相色譜儀檢測,將計算的特征峰面積參數與標準曲線(使用不同濃度風味物質標品的無水乙醇溶液制作)比對后定量:芳樟醇標曲:y=1291.1x-0.59524,R2=0.9999;庚醇標曲:y=1210.5x-17.257,R2=0.9956;薄荷醇標曲:y=174.62x-66.32,R2=0.9995,其中y為峰面積,x為風味物質濃度(芳樟醇、庚醇為μl/mL,薄荷醇為μg/mL)。

氣相色譜儀的檢測參數為:載氣為氦氣,流速1 mL/min,線速度40 cm/s;進氣分流比50∶1;檢測器為氫焰離子化檢測器(FID);進樣口溫度:250 ℃,檢測器溫度:300 ℃;升溫程序:柱箱溫度在50 ℃下保持1 min后每分鐘升溫25 ℃至100 ℃,再以每分鐘7 ℃升溫至240 ℃并持續1 min。

包合率(IEF,%)=包合物中的風味物質含量/初始添加量×100

1.2.7 掃描電鏡分析 三種風味物質包合物和它們的包合壁材的掃描電鏡圖通過S-4800掃描電鏡儀獲得。將樣品通過導電雙面膠固定于樣品載體片上,氣流吹去未穩定粘合的樣品,噴鍍鉑金粉后放入機器準備觀察。觀察時放大倍率為2000,壓力3.0 kV[14]。

1.3 數據統計分析

試驗數據均使用Origin 8.0及Excel 2007軟件進行分析處理,試驗結果采用平均值±標準差進行表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶濃度對脫支淀粉包合率的影響 圖1為酶濃度單因素實驗結果,隨著酶濃度增大,脫支淀粉與風味物質所形成包合物的包合率均呈現先增大再減小的趨勢,酶濃度為20 mg/g時,芳樟醇包合物取得最高包合率78.12%,當酶濃度增大到30 mg/g時,包合率出現下降,酶濃度繼續增大包合率降幅較小;酶濃度由10 mg/g增加至30 mg/g時,庚醇包合物的包合率持續呈近似線性增大,并在30 mg/g酶濃度時取得最高包合率73.64%,酶濃度繼續增大,包合率持續降低;薄荷醇包合物的包合率隨酶濃度上升變化幅度較小,酶濃度為40 mg/g時,取得最高包合率81.26%,由圖1可得,芳樟醇與庚醇對壁材脫支時酶濃度這一條件的變化反應更為劇烈,當酶解程度過大,包合率降幅較大,薄荷醇包合物則更為平緩。

圖1 酶濃度單因素實驗結果Fig.1 Single factor experiments results of enzyne concentration

2.1.2 底物濃度對脫支淀粉包合率的影響 圖2為底物濃度單因素實驗結果,隨著壁材與芯材的質量比不斷增大,三種風味物質包合物的包合率呈先增大再減小的趨勢,三種風味物質包合物的包合率均在底物濃度為0.04 g/mL時取得最大值,分別為芳樟醇包合物78.50%,庚醇包合物68.67%,薄荷醇包合物83.51%,由圖可得,當底物濃度為最低值0.01 g/mL時,三種風味物質取得的包合率均偏低,隨著底物濃度的增大,漲幅較大,說明此參數水平對包合率影響較大,當底物濃度繼續增大到0.05 g/mL時,庚醇包合物包合率出現較明顯下降,芳樟醇次之,薄荷醇降幅最小,反映了芳樟醇和庚醇對壁材脫支程度的敏感度高于薄荷醇。對不同的風味物質,取得最高包合率的參數值不完全相同,不同風味物質對壁材的要求有差異性。

圖2 底物濃度單因素實驗結果Fig.2 Single factor experiments results of substrate concentration

2.1.3 脫支時間對脫支淀粉包合率的影響 圖3為脫支時間單因素實驗結果,脫支時間由10 min增加至50 min,三種風味物質包合物的包合率呈先增大再減小的趨勢,酶解時間為20 min時芳樟醇和庚醇的包合物取得最高包合率,分別為76.63%和74.38%,當脫支時間繼續增加,芳樟醇與庚醇包合物的包合率均持續下降,而薄荷醇包合物則繼續升高,在脫支時間為30 min時取得最大值86.50%,可見薄荷醇相比芳樟醇和庚醇,更適應脫支程度較高的壁材。

圖3 脫支時間單因素實驗結果Fig.3 Single factor experiments results of debranching time

2.2 正交試驗結果

在單因素實驗的基礎上,通過正交試驗的方法繼續優化壁材的制備參數,使其包合對應的風味物質時取得相對較高的包合率。芳樟醇包合物正交試驗結果如表4所示,試驗組中因素水平取A2B2C3時取得最大包合率79.50%,根據k值得最佳組合水平為A2B2C2,通過驗證實驗得因素水平取A2B2C2時的包合率為78.62%,因此最佳因素水平為A2B2C3。最高包合率為79.50%。由極差R可得,A、B、C三個因素對包合率的影響程度大小順序為A>B>C,也就是脫支時間>底物濃度>酶濃度。芳樟醇包合壁材的最佳脫支工藝參數為:脫支時間20 min,底物濃度0.04 g/mL,酶濃度 30 mg/g。

表4 芳樟醇包合物正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal array design of linalool-complex

庚醇包合物正交試驗得結果如表5所示,在試驗組中因素水平取A2B1C2時取得最大包合率75.50%,根據k值得最佳組合水平為A2B2C3,取得包合率69.79%,因此最佳因素水平為A2B1C2,最高包合率為75.50%。由各因素的極差R可得,各因素對庚醇包合率的影響大小順序為A>C>B,脫支時間>酶濃度>底物濃度,庚醇包合材料制備的最佳工藝參數為脫支時間20 min,底物濃度0.03 g/mL,酶濃度30 mg/g。

薄荷醇包合物正交試驗得結果如表6所示,通過驗證實驗得試驗組中因素水平取A2B3C1時取得最大包合率87.38%,根據k值得最佳組合水平為A2B2C2,通過驗證實驗得因素水平取A2B2C2時的包合率為74.07%,因此最佳因素水平為A2B3C1,最高包合率為87.38%。由極差R可得,A、B、C三個因素對包合率的影響程度大小順序為C>B>A,即酶濃度>底物濃度>脫支時間,薄荷醇包合壁材的最佳脫支工藝參數為:脫支時間30 min,底物濃度0.05 g/mL,酶濃度30 mg/g。

表6 薄荷醇包合物正交試驗結果Table 6 Results of orthogonal array design of menthol-complex

經過正交試驗優化壁材的制備參數后,三種風味物質包合物能達到本試驗的最高包合率:分別是79.50%(芳樟醇)、75.50%(庚醇)和87.38%(薄荷醇)。如表7所示,在對照試驗中使用糊化后的秈米原淀粉包合這三種風味物質得到的包合率分別為:59.93%(薄荷醇)、55.71%(庚醇)、58.28%(薄荷醇)。從上述實驗結果可以得到,經過異淀粉酶適度脫支水解后的秈米淀粉的包合能力得到了顯著提高;每種風味物質的理化性質有差別,對最適壁材的要求也有所不同,經過試驗優化后的壁材更滿足對其包合的要求[15-16]。

表7 秈米脫支淀粉與原淀粉包合率結果比較Table 7 The comparation reaults of inclusion ratio between Indica rice starch and debranched indica rice starch

2.3 包合壁材基本性質測定

芳樟醇、庚醇以及薄荷醇的包合壁材的直鏈淀粉含量、溶解度以及水解程度如表8所示。試驗所用秈米原淀粉的直鏈含量為17.10%,經異淀粉酶的脫支處理,包合壁材的直鏈淀粉含量增大,提供更多的疏水空腔以滯留小分子成分。秈米淀粉不溶于水,溶解度的提高可以擴大應用范圍,提升口感,但易吸水受潮影響貯藏。DE值被用來表征淀粉水解程度,異淀粉酶發揮脫支作用的同時水解淀粉分子,縮短分子鏈長。降解淀粉基材料被用作包合壁材時DE值需要被控制在合適的指標范圍內,揮發物的保留值與載體DE有著直接關系,一定范圍內保留值隨著DE值的增加而增加[17-18]。但過高的水解程度使得粉末喪失自由流動能力的相對濕度變低,研究表明原淀粉抗水分濕度的臨界值為RH70,DE值5的淀粉水解物抗水分濕度的臨界值為RH68,而DE值20的淀粉水解物抗水分濕度的臨界值則降低到RH32[17]。本文中經正交試驗優化后的脫支淀粉水解程度控制在DE值10～20之間,既可以發揮保護功能,又能在正常的水分濕度下保存,因此本課題制備的壁材在DE值方面的評價是良好的。

表8 包合壁材基本性質測定結果Table 8 Determination of basic properties of wall materials

2.4 SEM分析

掃描電鏡結果如圖4所示。掃描電鏡觀察了芳樟醇包合物、庚醇包合物、薄荷醇包合物以及它們的包合壁材的表面形態學特征和差異。經過脫支后的秈米淀粉為無定型的片層結構,這種片層結構表面不光滑,有褶皺和凹凸形態的存在,厚度不均勻,而且有很多的彎曲重疊的結構存在,突出了玻璃態無定型結構的特點,有相似研究表明這種玻璃態無定型的褶皺能對小分子風味物質起到較好的保護作用[19]。在脫支反應之前,進行了淀粉的糊化,糊化極大地破壞了淀粉的晶體結構,使完整的立體網絡構型全部散開成為較為均勻平滑的片層結構,再經過脫支秈米淀粉組成發生變化,聚合度分布范圍跨度較大[20-21],使得形成的物質形態結構更趨向于無定型結構。樣品脫支程度控制在DE值10～20,長鏈淀粉分子仍然占據總體的大部分,分解出來的小分子成分依附在主鏈結構的表面,這種粘附是隨機的,因此可以觀察到壁材表面并不平滑,觀察到不同部分的形態和質地有差別。

圖4 包合壁材以及包合物的SEM圖Fig.4 SEM micrographs of wall-materials and inclusion complexes注:a1芳樟醇包合壁材;a2芳樟醇包合物;b1庚醇包合壁材;b2庚醇包合物;c1薄荷醇包合壁材;c2薄荷醇包合物。

對比包合物與包合壁材,觀察到包合物的表面多出很多的孔洞結構,有一部分是未穿透的孔洞結構。根據張舒[6]、黃惠芳等[8]研究,這些孔洞結構可能表征了包合物中風味物質分子的釋放活動。

3 結論

實驗表明,使用酶活力為115 U/mg的異淀粉酶對秈米淀粉進行酶解脫支處理,在一定程度上水解秈米淀粉,使其在包合芳樟醇、庚醇和薄荷醇時取得了更高的包合率。脫支時間為20 min、底物濃度0.04 g/mL、酶濃度30 mg/g,包合芳樟醇的包合率達到79.50%;脫支時間20 min、底物濃度0.03 g/mL、酶濃度30 mg/g、包合庚醇的包合率為75.50%;脫支時間30 min、底物濃度0.05 g/mL、酶濃度30 mg/g,包合薄荷醇的包埋率為87.38%,相比秈米原淀粉有顯著提高。脫支淀粉直鏈淀粉分子含量由17.1%分別提高至32.01%、38.66%和34.52%,DE值介于10～20,同時呈無定型的玻璃態結構,具備良好的微膠囊壁材性質。本研究為淀粉基微膠囊壁材的優化發展提供了一定的參考價值。