一測多評法測定食用玫瑰中5種非揮發性成分的含量

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(1.貴州師范大學貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室,貴州貴陽 550001; 2.貴州師范大學分析測試中心,貴州貴陽 550001; 3.貴陽市第三實驗中學,貴州貴陽 550001; 4.喀斯特地區生物與信息技術協同創新中心,貴州貴陽 550001)

食用玫瑰是一種藥食同源植物,隸屬薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(RosaL.),研究表明其含揮發油、黃酮類、多酚等多種化學成分[1],具有較強抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等功效[2],對心血管和神經系統等均具有保護作用。食用玫瑰主要活性成分除揮發油中的單萜類外[3],其類黃酮成分蘆丁、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有抗氧化、抗血小板活化因子等作用[4],金絲桃苷和槲皮素具有抗腫瘤、止痛和免疫調節等作用;酚酸類成分綠原酸具有抗菌、抗炎、降血糖等功能[5-6],均與其藥理活性相符。

目前,食用玫瑰開發多集中在其揮發性成分提取,而中國藥典[7]僅以浸出物測定為玫瑰質量控制標準,部分文獻雖有關于類黃酮化合物含量的研究[8-11],但存在指標單一,控制方法簡單等局限性。而多指標的質量控制模式需要對照品的種類和數量均較大,且部分對照品價格昂貴時,一測多評法的多指標模式以樣品中對照品廉價易得的常見成分為內標,建立該成分與其他成分間的相對校正因子,在通過校正因子計算出其他成分的含量。試驗中可在只有一個對照品而其余對照品不足的情況下,實現這些成分的同步含量測定。該方法已成功應用于當佐、丹參注射液、速效救心丸、雙青咽喉片、雙黃連口服液等中藥的質量監控[12-16],其中黃連藥材的一測多評法被2010年版中國藥典采用[7]。為體現食用玫瑰多成分、多層次和多靶點的特點,充分利用植物資源提升食用和藥用價值,參考相關文獻[17-22],蘆丁由外部標準來確定食用玫瑰中蘆丁的含量,使用直接進行校準,同時作為內部標準確定其他四個物質即金絲桃苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素和綠原酸的相對校正因子。在本試驗中采用外標法進行測定樣品中蘆丁的量,測定樣品中蘆丁的量后根據樣品中蘆丁的量、相對校正因子以及其他組分的峰面積進行計算得出樣品中其他成分的量。

本研究以蘆丁為內參物,建立并驗證一測多評法同時計算食用玫瑰中蘆丁、金絲桃苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素和綠原酸5個非揮發性成分含量可行性,為建立食用玫瑰質量標準和品質監管提供數據和方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁(批號:0080-9504)、槲皮素(批號:100081-200406)、金絲桃苷(批號:111521-200303)綠原酸(批號:110753-200212) 中國藥品生物制品檢定所;芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(批號:wkq16080705) 四川省維克奇生物科技有限公司;甲醇(≥99.9%)、乙腈 色譜純,天津科密歐化學試劑有限公司;磷酸 含量≥85.0%,成都市科龍化工試劑廠;其他試劑 均為分析純;水 自制超純水;食用玫瑰 2017年產約含77%水份的新鮮重瓣紅玫瑰花苞,由位于貴州省貴陽市惠水縣玫瑰種植基地提供。

Agilent 1100系統高效液相色譜儀,配置在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、DAD檢測器、Agilent色譜工作站 安捷倫科技有限公司;AL-204電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;CH-250超聲波清洗機 北京創新德超聲電子研究所;移液槍(量程為20～200 μL和100～1000 μL 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷對照品適量,用甲醇制成質量濃度分別為0.9400、0.8200、0.9800、1.1600、0.9600 mg·mL-1的10 mL對照品儲備液。精密移取適量對照品儲備液,將對照品儲備液用甲醇分別稀釋成槲皮素質量濃度為0.0118 mg·mL-1、蘆丁質量濃度為0.1804 mg·mL-1、綠原酸質量濃度為0.1862 mg·mL-1、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷質量濃度為0.2320 mg·mL-1、金絲桃苷質量濃度為0.3600 mg·mL-1混合對照品溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備 取食用玫瑰適量,粉碎,過20目篩,精確稱取5.0 g粉末,置具塞錐形瓶中,加入70%甲醇10.0 mL,稱定質量,使用輸出功率300 W,工作頻率40 kHz的超聲波清洗機超聲30 min,室溫下放冷,用70%甲醇補足缺失的質量數,搖勻,經0.45 μm微孔濾膜過濾,取續濾液,即得待測樣品。

1.2.3 色譜條件 色譜柱(Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm));流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～8 min,10%～15% A;8～12 min,15%～17% A;12～12.1 min,17%～21% A;12.1～26 min,21%～23% A;26～47 min,23%～57% A);體積流量1.0 mL·min-1;檢測波長354 nm;柱溫 35 ℃;進樣量10 μL。

1.2.4 線性關系考察 吸取“1.2.1”項下混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL,注入液相色譜儀。以峰面積為縱坐標(Y),進樣量為橫坐標(X)進行線性回歸,分別得到槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷的線性回歸。

1.2.5 精密度試驗 精密吸取“1.2.1”項下混合對照品溶液10 μL,在“1.2.3”項色譜條件下連續進樣6次,測得槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷峰面積,通過計算RSD以考察儀器的精密度。

1.2.6 重復性試驗 取同一份樣品,按“1.2.2”項下方法平行制備6份樣品溶液,在“1.2.3”項色譜條件下測定槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷峰面積,通過計算RSD以考察實驗的重復性。

②獲得多重隨機森林中每一個子隨機森林模型對測試數據集D的預測率,將所有預測結果放入以整型數為K值,以預測率為V的Map集合中,如下所示:

1.2.7 穩定性試驗 精密吸取“1.2.2”項下同一樣品溶液各10 μL,在“1.2.3”項色譜條件下于0、4、8、12、16、20、24 h進樣,測定槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷峰面積,通過計算RSD以考察樣品的穩定性。

1.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有已知量的樣品6份,每份2.5000 g,置具塞的50 mL錐形瓶中,分別加入一定量的“1.2.1”項下0.940 mg·mL-1槲皮素、0.820 mg·mL-1蘆丁、0.980 mg·mL-1綠原酸、1.160 mg·mL-1芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、0.960 mg·mL-1金絲桃苷對照品儲備液,按“1.2.2”項下方法制備各樣品溶液,在“1.2.3”項色譜條件下測定。

1.2.9 樣品含量的測定 按“1.2.2”項下方法制備6批樣品溶液,平行3份,分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液10 μL,進樣測定,記錄槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷的峰面積。在本試驗中采用外標法測定樣品中蘆丁的量，測定完樣品中蘆丁的量之后，再根據樣品中蘆丁的量、相對校正因子以及其他峰面積進行計算得出樣品中其他成分的量，即分別采用外標法(ESM)和一測多評法(QAMS)計算其含量。

1.2.10 耐用性分析

1.2.10.1 不同色譜柱的考察 在同一高效液相色譜儀(Agilent1100),在“1.2.3”項色譜條件下考察兩種色譜柱[A柱:Aglient C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、B柱:Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)]對玫瑰花中槲皮素、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷的相對校正因子的影響。

1.2.10.2 不同柱溫的考察 在同一高效液相色譜儀(Agilent1100),在“1.2.3”項色譜條件下考察了柱溫分別為30、35 ℃時的相對校正因子的影響。

1.2.10.3 不同流速的考察 在同一高效液相色譜儀(Agilent1100),考察了采用A柱,流速為0.8、0.9、1.0 mL·min-1時的相對校正因子。

1.3 數據處理

利用Excel軟件進行數據統計,并使用Excel軟件進行數據分析。相對校正因子計算公式為fs/k=(Ck×As)/(Cs×Ak),式中AS為內參物峰面積,CS為內參物濃度,Ak為待測組分的峰面積,Ck為待測組分K的濃度。

2 結果與分析

2.1 相對校正因子的計算

表1 樣品中待測成分的相對校正因子Table 1 RCFs of target compounds in sample

2.2 線性關系考察

按“1.2.4”項下進行試驗,結果見表2。結果表明,綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素含量在0.0931～0.3724、0.0902～0.3608、0.1800～0.7200、0.1856～1.1600、0.0059～0.0236 mg/mL范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

表2 線性關系考察試驗結果Table 2 Calibration curve and linear range

2.3 精密度試驗

槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷峰面積RSD分別為1.2%、0.8%、0.9%、1.3%、0.7%,表明,以槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷建立的高效液相色譜法精密度良好。

2.4 穩定性試驗

槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷峰面積RSD分別為0.9%、1.2%、1.1%、0.8%、1.0%,表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 重復性試驗

槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷含量RSD分別為0.8%、0.9%、2.6%、1.2%、2.4%,表明該方法重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗

按“1.2.8”項下進行試驗,結果見表3。由表3結果可知,各測定成分加標回收率在98.02%～99.51%之間,說明各成分回收率良好。

表3 加樣回收率試驗結果Table 3 Result of recovery tests

續表

2.7 樣品含量的測定

按“1.2.9”項下采用外標法(ESM)和一測多評法(QAMS)計算槲皮素、蘆丁、綠原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷含量,結果見表4。由表4可知,外標法和一測多評法測定結果基本一致,RSD≤1.0%,表明一測多評法在食用玫瑰花中的適用性和可行性得到了驗證。

表4 樣品測定結果Table 4 Results of sample determination

2.8 耐用性分析

2.8.1 不同色譜柱的考察 采用不同品牌的C18柱A、B對綠原酸、金絲桃苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素相對校正因子的影響結果見表5。兩種色譜柱下的各成分的相對校正因子的RSD均≤1.0%,表明相對校正因子重復性良好,兩種色譜柱的條件下對食用玫瑰各成分對相對校正因子無顯著影響,后采用常用的A柱對其他因素進行考察。

表5 不同色譜柱的考察Table 5 Investigation of different chromatographic columns

2.8.2 不同柱溫的考察 柱溫分別為30、35 ℃時,對相對校正因子的影響結果見表6。兩種溫度下的各成分的相對校正因子的RSD均≤1.0%,表明相對校正因子重復性良好,兩種不同柱溫條件下對食用玫瑰各成分對相對校正因子無顯著影響,35 ℃下出峰較好,采用35 ℃對其他因子進行考察。

表6 不同柱溫的考察Table 6 Study on the temperature of different chromatographic columns

2.8.3 不同流速的考察 在同一高效液相色儀(Agilent1100),采用A柱,流速為0.8、0.9、1.0 mL·min-1時對相對校正因子的影響結果見表7。三種流速下的各成分的相對校正因子的RSD均≤ 1.0%,表明相對校正因子重復性良好,三種流速下對食用玫瑰各成分對相對校正因子無顯著影響。按照1.2.3項色譜條件下分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL,進樣分析,結果見圖1,樣品以及混合對照品色譜峰分離度較好,其他色譜峰對含量測定無干擾。

表7 不同流速的考察Table 7 Study on the flow rate of different chromatographic columns

圖1 對照品(A)、樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of control(A),sample(B)注：1.綠原酸;2.蘆丁;3.金絲桃苷;4.芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷;5.槲皮素。

3 結論

本研究中蘆丁作為樣品中的待測組分,可近似看作內標物質,但嚴格講并不是內標物質:首先,內標物質的選擇首先樣品中不能存在;其次,內標物為人為加入的標準品,此時加入的標準品為已知量,并且加入的量在儀器被檢測的范圍內,而本試驗中蘆丁為樣品中含有物,并且量為未知。

綜上所述,本文采用一測多評法測定食用玫瑰中5種成分的含量,建立并采用內標法驗證一測多評法同時計算食用玫瑰中5種非揮發性成分含量的可行性,結果表明本方法操作簡單、測定結果準確,可為建立食用玫瑰質量標準提供數據和方法參考。同時,將其類黃酮活性成分用于醫藥行業、人們日常飲用提供其附加值,這對開發潛在新藥的同時深化對食用玫瑰的認識,開發食用玫瑰的社會和經濟價值具有廣泛意義。