HPLC測定顯齒蛇葡萄葉中4種黃酮類化合物的含量

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(1.貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550025; 2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室,貴州貴陽 550014; 3.貴州省產品質量監督檢驗院,貴州貴陽 550004)

顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang),為葡萄科蛇葡萄屬的藤本植物[1],既可以藥用也可以食用[2]。用顯齒蛇葡萄嫩葉制成的類茶飲料藤茶具有清熱解毒和利濕消腫的功效,主治咽喉腫痛、黃疸型肝炎、抗動脈粥樣硬化等癥[3-4]。研究表明,黃酮類化合物是顯齒蛇葡萄的主要活性成分,其中二氫楊梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤[5]、降低血脂和血糖水平,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性等功效[6-8];楊梅素具有抗炎、抗氧化、抗過敏、降血糖和保肝[9-11]等功效;香橙素具有抗氧化的功效[12];楊梅苷具有降血壓的功效[13]。

顯齒蛇葡萄黃酮類化合物中主要是二氫楊梅素,所以目前對顯齒蛇葡萄的質量監控大多以檢測二氫楊梅素的含量為主,有HPLC和紫外分光光度法[14]。二氫楊梅素熱穩定性差,在檢測過程中不應該用加熱方法提取[15],近兩年已經有了HPLC測定二氫楊梅素、楊梅素和楊梅苷的相關報道,常敬芳等建立了顯齒蛇葡萄莖中二氫楊梅素和楊梅素的HPLC測定方法[16],易開等建立了顯齒蛇葡萄總黃酮提取物中二氫楊梅素、楊梅素和楊梅苷的HPLC測定方法[17]。但是到目前為止并沒有建立同時測定四種黃酮類化合物的相關報道。

本課題組在測定了不同產地同一采收期顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素和楊梅素含量的基礎上,進一步探索同時測定二氫楊梅素,楊梅素,香橙素,楊梅苷4種黃酮類化合物的HPLC方法,以期為顯齒蛇葡萄質量標準的建立和進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang) 采自2012～2015年每年4～9月12個不同產地(不同產地同一采收期編號:貴州施秉GS,貴州江口GJ,貴州貞豐GZ,貴州石阡GS,貴州佛頂山GF,重慶酉陽CY,江西大余JD,湖南郴州HC,湖南衡東HH,廣東連州GL,廣西恭城GG,廣西平樂GP。同一產地不同采收期編號:貴州江口JK),經貴州師范大學余正文教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬的干燥葉,樣品產地及編號見表1和表2;二氫楊梅素(>98%),楊梅苷(>98%),香橙素(>98%),楊梅素(>98%) 江蘇永健醫藥科技有限公司;甲醇、乙腈 天津科密歐化學試劑有限公司色譜純;實驗用水 為重蒸水;所用其他試劑 均為分析純。

Ultimate 3000 高效液相自動進樣色譜儀 賽默飛;紫外檢測器 Dionex Corp:Hypersil ODS 25 μm(250 mm×4.6 mm,5 μm) 依利特公司;CPA225D電子天平 Sartorius Corp;KQ-300VDE型三頻數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS 25 μm(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(5∶11)-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫:0～10 min,20∶80;11～20 min 40∶60;21～25 min 20∶80。檢測波長:325 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃.

1.2.2 標準品溶液的制備 取在干燥器(P2O5)中放置24 h的二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素標準品適量,精密稱定,置容量瓶中,加甲醇超聲(功率300 W,頻率45 kHz,30 min)使完全溶解,配制成標準品溶液以備制作標準曲線。標準品溶液中二氫楊梅素濃度為7956 μg/mL,楊梅苷濃度為166 μg/mL,香橙素濃度為290 μg/mL,楊梅素濃度為2936 μg/mL。

1.2.3 供試品溶液的制備 處理方法主要參照雷華平[18]、陳敏[19]和林詩瑤[20]的方法并略加改進,具體如下:將顯齒蛇葡萄葉在60 ℃恒溫烘干至質量恒定,粉碎過60目篩。取顯齒蛇葡萄約0.5 g,精密稱定,置于100 mL帶塞三角瓶中,精密加入50 mL甲醇,密塞,搖勻,連續超聲提取30 min,冷卻至室溫,補足失重,搖勻,過0.22 μm微孔有機相濾膜,濾液供HPLC分析用。

1.2.4 線性范圍的考察 精密量取混合標準品儲備液適量,逐級稀釋,配制成不同濃度的混合標準品溶液。精密吸取上述不同濃度的混合標準品溶液10 μL,進樣分析,測定峰面積。以進樣濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,計算得回歸方程。二氫楊梅素,楊梅苷,香橙素,楊梅素的線性回歸方程分別為二氫楊梅素:Y=0.1418X-4.3039(R2=0.9996);楊梅苷:Y=0.3421X-1.4427(R2=0.9997);香橙素:Y=0.1973X+0.0187(R2=0.9994);楊梅素:Y=0.4352X-0.0054(R2=0.9999)。

1.2.5 精密度實驗 精密吸取混合標準品溶液10 μL,在“1.2.1”項條件下平行測定6次,記錄二氫楊梅素,楊梅苷,香橙素,楊梅素峰面積。

1.2.6 穩定性實驗 精密吸取JK-10號樣品供試品溶液,按“1.2.1”項下色譜條件,分別于0、2、4、6、8、12 h進樣10 μL,測定二氫楊梅素,楊梅苷,香橙素,楊梅素峰面積,計算相對標準偏差。

1.2.7 重復性實驗 分取JK-10號樣品粉末,共取6份,各約0.5 g,精密稱定,按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液,平行操作6份,按“1.2.1”項下色譜條件,測定峰面積并計算各組分的平均質量分數。

1.2.8 加樣回收率實驗 取已知含量的JK-10號樣品粉末9份,約0.5 g,精密稱定。精密加入4種黃酮類化合物對照品,按“1.2.1”項下色譜條件測定,計算二氫楊梅素,楊梅苷,香橙素,楊梅素的加樣回收率及平均回收率。

1.2.9 樣品含量測定 取85批不同產地(貴州施秉、貴州江口、貴州貞豐、貴州石阡、貴州佛頂山、江西大余、湖南郴州、湖南衡東、重慶酉陽、廣東連州、廣西恭城、廣西平樂);取24批同一產地(貴州江口)不同采收期顯齒蛇葡萄樣品,分別按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液,每批平行操作3份。分別精密吸取各供試品溶液10 μL,注入高效液相色譜儀,按“1.2.1”項下條件測定,計算二氫楊梅素,楊梅苷,香橙素,楊梅素含量。

1.3數據統計分析

實驗數據分別由Excel,Origin 9.0和SPSS軟件處理。

2 結果與分析

2.1 系統適應性實驗 分別精密吸收混合標準品、供試品溶液各10 μL,按“1.2.1”項條件進樣。在該色譜條件下,二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素的保留時間分別為6.687、8.833、11.800、12.887。理論塔板數不低于3000,各成分分離成都均大于1.5;表明該方法專屬性較好。色譜圖結果見圖1。

圖1 標準品(A)和顯齒蛇葡萄樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of standard sample(A) and Ampelopsis grossedentata sample(B)注:1:二氫楊梅素;2:楊梅苷;3:香橙素;4:楊梅素。

2.2方法學考察

2.2.1 線性范圍考察結果 二氫楊梅素進樣濃度在7.8～7956 μg/mL、楊梅苷進樣濃度在14.2～1174.4 μg/mL、香橙素進樣濃度在2.9～290 μg/mL、楊梅素進樣濃度在0.7～46.5 μg/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系。

2.2.2 精密度實驗結果 二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素的平均峰面積分別為1114.5615、484.7409、56.5548、404.6557,其RSD分別為0.0、0.1%、0.8%、0.2%。

2.2.3 穩定性實驗結果 供試品溶液中測定二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素質量分數的RSD值分別為1.2%、1.1%、0.2%、0.3%。表明供試品溶液中的二氫楊梅素,楊梅苷,香橙素,楊梅素均能在12 h內保持穩定。

2.2.4 重復性實驗結果 二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素質量分數的RSD值分別為1.2%、1.1%、0.2%、0.3%。

2.2.5 加樣回收率實驗結果 該分析方法的回收率98.00%～100.12%,98.95%,RSD值為0.85%;98.75%～101.86%,100.14%,RSD值為1.07%;99.14%～101.24%,100.21%,RSD值為0.84%;98.25%～99.45%,98.81%,RSD值為0.59%。

2.3樣品含量測定

結果見表1,表2。

表1 不同產地同一采收期的顯齒蛇葡萄葉中4種黃酮類化合物的含量(%)Table 1 The contents of 4 flavones from Ampelopsis grossedentata leaves in the same harvest period and different habitats(%)

續表

續表

表2 貴州省江口縣不同采收期的顯齒蛇葡萄葉中4種黃酮類化合物的含量(%)Table 2 The contents of 4 flavones from Ampelopsis grossedentata leavesin the Jiangkou County Guizhou Province and different harvest periods(%)

續表

不同產地同一采收期的顯齒蛇葡萄樣品中的二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素百分含量范圍分別在0.3003%～34.1934%,0.0722～1.7105%,0.0033%～1.167%,0.0007%～0.3309%之間。采于貴州及重慶的顯齒蛇葡萄樣品中可以檢測出四種黃酮類化合物的含量,但在其他省份中則未檢測到香橙素和楊梅苷的含量。

不同采收期的顯齒蛇葡萄樣品中的二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素百分含量范圍分別在0.3362%～7.6490%,0.0391%～2.9616%,0.0017～0.8361%,0.0019%～0.1050%之間。可見,二氫楊梅素含量隨著采收期的延長先升高再降低,楊梅苷含量隨著采收期的延長而降低,香橙素和楊梅苷的含量均較低,且在不同采收期處于動態變化之中。

3 結論

二氫楊梅素、楊梅苷、香橙素、楊梅素等黃酮類化合物是顯齒蛇葡萄的主要活性成分,本實驗建立的HPLC測定顯齒蛇葡萄中4種黃酮類化合物含量的方法,針對4種成分進行分析,專屬性強、簡便可靠,可以更全面地對該樣品進行質量控制。可以看出,顯齒蛇葡萄中香橙素和楊梅苷的產生很可能與環境作用因素有關,為初步判斷顯齒蛇葡萄的來源提供基本依據,為顯齒蛇葡萄的化學生態學研究奠定基礎。此外,不同的采收期對化合物的影響也較大,可以根據需要高含量的化合物有針對性的選擇不同的采收期來進行采集樣品,對于進一步開發該植物的有效功能成分提供依據。