同時蒸餾萃取法和頂空固相微萃取法提取茯磚茶揮發(fā)性成分的比較分析

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(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410128; 2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南長沙 410128; 3.益陽茶廠有限公司,湖南益陽 413046; 4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南長沙 410128; 5.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410128)

茯磚茶屬于黑茶類,主產(chǎn)于湖南省,是湖南省茶產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵組成部分[1]。茶葉色、香、味等品質(zhì)特征不同源于其內(nèi)含成分的組成及比例的差異,茯磚茶加工過程中其內(nèi)含成分在微生物參與和濕熱作用下發(fā)生了復(fù)雜的變化,形成了其特有的品質(zhì)風(fēng)格[2-3]。香氣物質(zhì)是決定茶葉品質(zhì)的重要因素之一[4]。茶葉的香氣成分主要是揮發(fā)性與半揮發(fā)性化合物,含量低,且復(fù)雜不穩(wěn)定,提取過程中還容易受外界條件影響,發(fā)生氧化縮合、聚合、基因轉(zhuǎn)移等復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng),所以其分析結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上取決于香氣物質(zhì)的提取方式[5]。

茶葉中常見的香氣提取方法有:減壓蒸餾萃取法(vacuum distillation extraction,VDE)[6]、頂空分析法(headspace analysis,HAS)[7]、吹掃捕集熱脫附解吸法(purge and trap thermal desorption,P&T-TD)[8]、超臨界流體萃取法(supercritical fluid extraction,SFE)[9]、同時蒸餾萃取法(SDE)[10]、固相微萃取法(solid-phase micro-extraction SPME)[11]等。各種提取方法各有優(yōu)劣性,在茶葉揮發(fā)性成分的提取中均存在著一定的不足,結(jié)合不同的提取方法,做到優(yōu)勢互補(bǔ),減少不足才能推進(jìn)香氣研究的進(jìn)展[8]。有研究表明:VDE法對水溶性香氣成分的提取效率較高,幾乎不能提取到脂溶性香氣成分[12];HAS捕集到的香氣物質(zhì)絕對量少,靈敏度低[7];P&T-TD法能吸附較易揮發(fā)和中等揮發(fā)性物質(zhì),得到的茶葉香氣成分較能真實(shí)地反應(yīng)茶湯沖泡的特點(diǎn),但目前研究較少[8,13];SFE法萃取效率高,選擇性好,但成本過高,普遍適用性差[14];SDE法是當(dāng)前香氣提取采用較多的一種較成熟的技術(shù),具有重復(fù)性好,效率高等優(yōu)點(diǎn)[15];但SDE法得到的成分以高沸點(diǎn)化合物為主,且部分成分可能是通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變而來的揮發(fā)性物質(zhì)[16]。SPME法是一種靈敏,無溶劑且經(jīng)濟(jì)的樣品制備方法,該法可縮短分析時間,已經(jīng)在不同類型茶葉揮發(fā)性組分的提取中被廣泛應(yīng)用[17-19]。

本文以茯磚茶為研究對象,研究了同時蒸餾萃取法(SDE)和頂空固相微萃取法(HS-SPME)并使用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-QQQ-MS)檢測茯磚茶揮發(fā)性成分,旨在比較兩種方法提取到茯磚茶揮發(fā)性成分的差異,找到更適合茯磚茶揮發(fā)性成分的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯磚茶樣品 湖南三十九鋪茶葉有限公司生產(chǎn)手筑茯磚;C8-C40偶數(shù)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 美國o2si公司;乙醚、無水硫酸鈉 均為國產(chǎn)分析純。

7890B氣相色譜7000C質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;手動SPME進(jìn)樣器、65 μm PDME/DVB固相微萃取頭、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司;AE240型電子天平 瑞士Mettler公司;DK-S28型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LDP-350型高速多功能粉碎機(jī) 浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 用錘子將茯磚茶分成4份,再在每份不同位置隨機(jī)取樣,用錘子擊碎合并,用粉碎機(jī)磨碎后作為待測試樣。

1.2.2 HS-SPME條件 將固相微萃取頭在氣相色譜儀的進(jìn)樣口經(jīng)250 ℃老化1 h備用;稱取1.2.1中的磨碎茶樣2 g,放入20 mL頂空瓶中,加入沸水10 mL,密封瓶口;將其置于80 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)平衡5 min;然后將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分,推出萃取頭離液面1 cm處,吸附60 min后取出,隨即插入儀器的進(jìn)樣口,于250 ℃解吸3.5 min,進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。所有樣品重復(fù)3次。

1.2.3 SDE條件 稱取茯磚茶磨碎樣50 g 置于同時蒸餾萃取裝置的2000 mL 圓底燒瓶中,加入1000 mL沸騰去離子水,用電熱套加熱。另一側(cè)圓底燒瓶中加入蒸餾純化的乙醚50 mL,用50 ℃水浴加熱。樣品微沸且冷凝管有回流液出現(xiàn)時開始計時,保持沸騰45 min。停止加熱后,加入少許無水硫酸鈉并置于冰箱中冷凍過夜脫水,氮?dú)鉂饪s除去大部分乙醚溶劑至1 mL,供GC-MS分析。所有樣品重復(fù)3次。

1.2.4 GC-MS分析條件 GC條件:色譜柱DB-35MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為氦氣(純度>99.999%),進(jìn)樣口溫度250 ℃,柱流速1 mL/min,分流比5∶1;升溫程序:50 ℃保持4 min,以5 ℃/min升到180 ℃,保持5 min,按8 ℃/min升到280 ℃,保持10 min。MS條件:離子源EI;離子源溫度230 ℃,接口溫度230 ℃,EI源能量:70 eV,電子倍增器電壓:2409 V,質(zhì)量掃描范圍50～550 u。

1.2.5 HS-SPME提取條件優(yōu)化 采用單因素逐步優(yōu)化的方法,以揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)量和總峰面積為指標(biāo),固定固液比(1∶4)、萃取溫度(80 ℃)以及萃取時間(60 min),分析比較 65 μm DVB/PDMS和50/30 μm CAR-DVB-PDMS兩種萃取頭對茯磚茶揮發(fā)性成分的萃取效果;以最優(yōu)萃取比較不同固液比(1∶3、1∶4、1∶5和1∶6)的萃取效果;以最優(yōu)萃取頭和固液比比較不同萃取溫度(60、70、80、90 ℃)的萃取效果;以最優(yōu)萃取頭、最優(yōu)固液比和萃取溫度比較不同萃取時間(40、50、60、70 min)對茯磚茶揮發(fā)性成分的萃取效果,確定最佳的萃取參數(shù)。單因素優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 HS-SPME提取單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 1 HS-SPME extraction parameters used in single factor design optimization

1.3 數(shù)據(jù)處理

保留指數(shù)測定:由GC-QQQ-MS得出C8～C40偶數(shù)位正構(gòu)烷烴標(biāo)樣、茯磚茶樣品各個色譜峰的保留時間(RI),計算各揮發(fā)性成分保留指數(shù),公式如下:

RI=100n+200×[RTx-RTn]/(RTn-2-RTn)

式中:RI為揮發(fā)性化合物的保留指數(shù),n為該化合物前一碳標(biāo)的原子數(shù),RTx為該化合物的保留時間,RTn為該化合物前一碳標(biāo)的保留時間,RTn+2為該化合物后一碳標(biāo)的保留時間。

根據(jù)得到的總離子流圖中各色譜峰的質(zhì)譜信息,經(jīng)NIST17 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索,然后將計算出來的RI值與文獻(xiàn)中進(jìn)行比對定性,最佳鑒定結(jié)果以質(zhì)譜相似度和RI值接近度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為準(zhǔn),無法得到保留指數(shù)的仍以質(zhì)譜匹配度最高為準(zhǔn)。同時,以峰面積歸一化法(組分峰面積占總峰面積的百分比)定量。數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行分析,圖片采用Origin 8.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME提取條件優(yōu)化

2種不同類型萃取頭提取效果比對結(jié)果如圖1A,可知PDME/DVB(65 μm)提取到揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和峰面積均大于DVB/CAR/PDMS(30/50 μm),65、30/50 μm兩種萃取頭提取到揮發(fā)性成分分別為50和47種。因此選定PDME/DVB(65 μm)萃取頭。固液比對提取效果影響結(jié)果如圖1B,隨著固液比的增大,提取到的揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)量峰總峰面積均增大,當(dāng)固液比為1∶5時提取到的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和峰面積達(dá)最大,因此提取固液比選為1∶5。溫度對提取效果影響結(jié)果如圖1C,當(dāng)溫度為70和80 ℃時提取到的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量最多,而且80 ℃時峰面積較大,因此提取溫度選為80 ℃。時間對提取效果影響結(jié)果如圖1D,隨著提取時間的增加,提取到的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和總峰面積呈增加趨勢,當(dāng)提取時間在60 min時揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和總峰面積達(dá)到最大,因此提取時間選為60 min。

圖1 提取條件對茯磚茶揮發(fā)性成分提取效果的影響(n=3)Fig.1 Effect of extraction conditions on extraction of volatile components from Fu brick tea注:A:萃取頭類型,B:提取固液比,C:提取溫度,D:提取時間。

2.2 SDE與HS-SPME提取茯磚茶揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量比較

利用優(yōu)化的HS-SPME條件和SDE法提取茯磚茶揮發(fā)性成分,經(jīng)GC-QQQ-MS分析。得到的總離子流圖如圖2所示,揮發(fā)性組分結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明:兩種方法共檢測到90種揮發(fā)性成分,其中SDE法檢測出79種,HS-SPME法檢測出50種,共有成分40種。共有成分分別占提取出總成分含量的72.20%±1.96%(SDE)和68.24%±4.79%(HS-SPME)。與HS-SPME法相比,SDE法可提取到較多數(shù)量的茯磚茶揮發(fā)性成分,但兩種方法均不能完全提取出茯磚茶揮發(fā)性成分。

圖2 SDE(A)與HS-SPME(B)提取茯磚茶揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 The total ion chromatogram of volatile components from Fu brick Tea by SDE and HS - SPME

表2 SDE與HS-SPME提取茯磚茶揮發(fā)性成分比較(n=3)Table 2 Comparison between SDE and HS-SPME extraction of volatile components of Fu brick Tea(n=3)

續(xù)表

續(xù)表

2.3 SDE與HS-SPME提取茯磚茶主要揮發(fā)性成分比較

比較兩種提取方法提取的揮發(fā)性成分(表2)可知:由SDE法提取到的的主要成分有植酮3.56%±0.20%、雪松醇3.36%±0.11%、棕櫚酸2.95%±1.13%、2,6-二叔丁基對甲酚2.89%±0.23%、二苯并呋喃2.76%±0.11%、菲2.40%±0.26%、香葉基丙酮1.79%±0.10%、鄰苯二甲醚1.73%±0.09%、鄰甲酚1.49%±0.07%、聯(lián)苯1.39%±0.11%等。由HS-SPME提取的主要揮發(fā)性成分有咖啡因6.69%±3.10%、鄰苯二甲酸二乙酯5.22%±0.78%、二苯并呋喃4.10%±0.15%、二氫獼猴桃內(nèi)酯4.04%±0.27%、聯(lián)苯3.85%±0.21%、香葉基丙酮2.88%±0.26%、植酮2.42%±0.13%、雪松醇2.30%±0.01%、菲2.01%±1.32%、1,2,3-三甲氧基苯2.01%±0.18%等。在主要揮發(fā)性成分中，棕櫚酸和2,6-二叔丁基對甲基苯酚僅SDE法提取出,咖啡因和鄰苯二甲酸二乙酯僅HS-SPME法提取出。兩種方法提取到的茯磚茶主要揮發(fā)性成分差異明顯且互有交叉。

2.4 SDE與HS-SPM提取茯磚茶揮發(fā)性成分種類比較

比較兩種方法各揮發(fā)性成分種類可知(圖3):SDE法檢測到碳?xì)浠衔?3種、醇類7種、雜氧化合物13種、醛類7種、酚類13種、酮類12種、酸類1種,含氮化合物3種,其中相對含量較高的是雜氧化合物9.87%±0.39%、酮類8.96%±0.13%、碳?xì)浠衔?.51%±0.11%和酚類7.41%±0.44%。HS-SPME法檢測到碳?xì)浠衔?0種、醇類4種、雜氧化合物10種、醛類5種、酯類2種、酚類9種、酮類9種和含氮化合物1種,其中相對含量較高的是酮類13.29%±0.36%、雜氧化合物10.83%±0.34%、碳?xì)浠衔?0.70%±1.25%和含氮化合物6.69%±3.10%。對于醇類、醛類和酚類化合物,在化合物種類和化合物相對含量兩方面SDE的萃取效果均優(yōu)于HS-SPME;而對于碳?xì)浠衔铩㈦s氧化合物和酮類,在化合物種類方面,SDE法萃取效果優(yōu)于HS-SPME,在化合物相對含量方面結(jié)果正好相反。這可能是由于不同類型化合物揮發(fā)能力和水溶性的差異造成的。

圖3 SDE與HS-SPME提取茯磚茶揮發(fā)性組分對比圖(n=3)Fig.3 The comparison chart of volatile components from Fu brick Tea by SDE and HS - SPME注:A:各類成分?jǐn)?shù)量,B:各類成分相對含量。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對HS-SPME的影響因素:萃取頭類型、萃取固液比、萃取溫度和時間等進(jìn)行優(yōu)化,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)固液比1∶6時,揮發(fā)性成分峰面積反而減少,這可能是由于沖泡用水量太多,不利于分析物質(zhì)揮發(fā)到液面上部空間,同時沖泡茶水太多導(dǎo)致液面上方的頂空體積減小,不利于萃取頭達(dá)到吸附平衡[20-21];當(dāng)溫度超過80 ℃揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)反而減少,這可能是由于吸附是一個放熱過程,高溫會降低萃取頭的吸附能力[22];當(dāng)提取時間超過60 min時揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和總峰面積反而減少,這可能是由于揮發(fā)性成分從纖維到樣品的反向擴(kuò)散試圖維持分區(qū)平衡[22-23]。

比較兩種提取方法發(fā)現(xiàn)提取到的茯磚茶揮發(fā)性成分差異較大,SDE法提取到的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量明顯多于HS-SPME法,這與Sheibani[24],王道平[25],王峰[26]等得出的結(jié)論一致。通過兩種方法提取到的茯磚茶揮發(fā)性成分以碳?xì)浠衔铩㈦s氧化合物、酮類和酚類為主,與文獻(xiàn)報道結(jié)論一致[27-29]。另外,咖啡堿僅HS-SPME法提取到,可能是由于咖啡堿在乙醚中溶解度小,很難被乙醚提取出來,所以SDE法提取的化合物檢測不到咖啡堿。棕櫚酸僅SDE法提取到的,這可能是棕櫚酸在持續(xù)加熱過程中由其他含氧化合物轉(zhuǎn)化而來[30]。

研究發(fā)現(xiàn)SDE和HS-SPME法各有優(yōu)劣,提取的成分互補(bǔ),兩種方法的結(jié)合分析避免了單一方法的局限性,能更加科學(xué)、客觀、完整地對茯磚茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定分析。