枸杞類胡蘿卜素研究進展

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(1.寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所,寧夏銀川 750002; 2.寧夏醫科大學實驗動物中心,寧夏銀川 750004)

枸杞屬(LyciumL.)屬于茄科(Solanaceae),在全球有80多種枸杞,主要分布在溫帶和亞熱帶地區。我國分布有7個種和3個變種,主產西北部和北部[1]。其中寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是我國主要的栽種枸杞種,其食用和藥用歷史已經有很長時間,在“清肝、明目、補氣”上有著廣泛的應用。但是有關其有效成分的分離鑒定、疾病治療的分子機制、臨床治療效果和安全性的研究直到最近20年才慢慢受到重視。

近年來,有關寧夏枸杞,尤其是其主要功效成分枸杞多糖和多種小分子成分在植物學、藥物化學、生物學和臨床醫學中的研究取得了很大的進展[2-4]。在一定程度上,促進了枸杞產業蓬勃發展,創造了極為可觀的經濟效益。截至2015年底,我國枸杞主要產區種植面積超過19萬公頃,枸杞干果年產量超過50萬噸。枸杞作為西北地區特別是寧夏回族自治區重點產業之一,在促進經濟社會發展等方面具有突出的驅動、支撐和引領作用。

盡管目前枸杞產業蓬勃發展,產業規模持續增長,但仍存在以下問題:第一,枸杞功能物質基礎研究薄弱,功能成分的結構表征、構效關系、生物功效與藥理作用機制不明確;第二,功能成分分離、提取工藝落后,缺乏規模化制備工藝及活性保持工藝;第三,枸杞產品單一,缺乏高附加值深加工產品等問題,這一現狀使得枸杞加工業不僅遠遠落后于世界發達國家的藥食兩用資源加工業的發展水平,而且滯后于自身產業發展的需要,整體上處于初級發展階段,成為制約農民增收、產業增效的瓶頸。

因此,枸杞功效成分基礎研究及其分離制備技術的突破是促進產業發展的關鍵。目前,研究較為深入的枸杞功效成分為多糖、黃酮及類胡蘿卜素等。其中,類胡蘿卜素是在光合生物中發現的一類天然色素,具有抗氧化性,可以預防癌癥、心血管疾病和老年黃斑病變。類胡蘿卜素在植物材料中含量和組成差異較大。不同含量和組成的類胡蘿卜素材料其功效活性差異較大。盡管枸杞及其類胡蘿卜素具有抗氧化、保護眼部、肝臟和心血管系統等作用[5-6],但是由于組成復雜,難以理清發揮這些有益效果的主要單體和具體的分子機制,導致有關枸杞類胡蘿卜保健機制研究遲遲未能取得突破,未能像番茄紅素等重要天然產物標志單體化合物那樣引起國際研究界的重視。本文圍繞枸杞類胡蘿卜素的發現和應用,就其結構分類、植物學代謝特征、功效作用和深加工產品研發進展進行簡要的綜述,并對其未來可能的研究與開發方向和內容進行展望。

1 枸杞類胡蘿卜素的結構和分類

類胡蘿卜素是具有多個共軛雙鍵的萜類化合物,是一類重要的天然色素的總稱,普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類中的黃色、橙紅色或紅色的色素之中。迄今,被發現的天然類胡蘿卜素已達600多種,在人體中存在的主要有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃素、番茄紅素以及β-隱黃素等[6]。根據目前枸杞類胡蘿卜素研究,枸杞類胡蘿卜素主要有三類組成:第一類,新黃質、隱黃質、葉黃素、玉米黃素等游離型類胡蘿卜素;第二類,以玉米黃素雙棕櫚酸為主的類胡蘿卜素酯化衍生物;第三類為類胡蘿卜素糖苷化衍生物[7-10]。

Inbaraj等鑒定了枸杞子中2個游離型類胡蘿卜素(玉米黃素和類胡蘿卜素)和7個類胡蘿卜素酯化衍生物(玉米黃素雙棕櫚酸酯、玉米黃素單棕櫚酸酯和隱黃質棕櫚酸酯)[7]。Hempel等分析結果表明,寧夏枸杞綠色未成熟果實中基本上含有的都是游離型類胡蘿卜素,而成熟果實中游離型類胡蘿卜素非常少,基本上都被脂肪酸酯化成類胡蘿卜素酯化衍生物[11]。Mia Isabelle等從新加坡收集到的枸杞材料中檢測到的類胡蘿卜素主要為新黃質、紫黃質和葉黃素,玉米黃素和番茄紅素含量極少[6]。米佳等分析了不同種質枸杞鮮果類胡蘿卜素組成情況,結果表明,9個材料中,其類胡蘿卜素含量和組成差異較大。總體而言,紅果枸杞中的總類胡蘿卜素含量和玉米黃素雙棕櫚酸酯含量顯著高于黃果枸杞。七個紅果枸杞樣品中均沒有檢測到玉米黃素,黃果枸杞中有少量的玉米黃素,其中,新品系15-32和黃果品系3-13的β-隱黃質含量顯著高于其它枸杞品種或品系[8]。Chung等[9-10]從中華枸杞果實甲醇提取物中分離得到了3個類胡蘿卜素糖苷化衍生物,這些化合物的四萜母核上均連有二條糖鏈,且每條糖鏈至少含有3個吡喃阿拉伯糖基,因此極性顯著增大。部分研究報道,寧夏枸杞的主要成分為玉米黃素(玉米黃質),這可能和HPLC樣品前處理進行皂化導致其他類胡蘿卜素轉化成了玉米黃素有關[12]。

2 枸杞類胡蘿卜素的植物代謝研究

在我國發現的枸杞七個種包括中華枸杞(LyciumchinenseMill.)、寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)、柱筒枸杞(LyciumcylindricumKuang& A.M.Lu)、新疆枸杞(LyciumdasystemumPojark.)、黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)、截萼枸杞(LyciumtruncatumY.C.Wang)、云南枸杞(LyciumyunnanenseKuang & A.M.Lu)等,三變種包括黃果枸杞(LyciumbarbarumL.var.auranticarpum K.F.Ching)、北方枸杞(LyciumchinenseMill.var.potaniniiPojark.A.M.Lu)和紅枝枸杞(LyciumdasystemumPojark.var.rubricaulium A.M.Lu)。Liu Y等研究表明,在寧夏枸杞和黑果枸杞果實的發育早期,葉綠體類胡蘿卜素(葉黃素、β-胡蘿卜素、紫黃質等)均有積累,總量為30～50 μg/g鮮重。隨著果實的發育成熟,這些類胡蘿卜素逐漸發生降解。在黑果枸杞果實的發育成熟過程中,沒有其他新的類胡蘿卜素成分合成,原有的葉綠體類胡蘿卜素逐漸減少至無。而在寧夏枸杞果實的發育成熟過程中,從變色期開始,枸杞類胡蘿卜素逐漸積累(同時還有枸杞類胡蘿卜素的合成前體β-隱黃質和β-胡蘿卜素的少量積累),直至成熟期積累為最大值(約400 μg/g鮮重)[13]。許多不同種或變種枸杞成熟果實外觀存在顏色差異,其類胡蘿卜素含量和組成也具有較大的差異[8],究其原因可能是色素積累的差異性。

Liu等認為,到果實成熟期時,寧夏枸杞中發育出了橙色圓形的有色體,但是黑果枸杞中沒有有色體的形成。這可能是黑果枸杞類胡蘿卜素不能合成積累的主要原因。在寧夏枸杞果實發育成熟過程中,枸杞類胡蘿卜素合成基因的表達量有普遍提高的趨勢。表達量提高比較明顯的基因有DXS2、PSY1、PDS、ZDS、CRTISO、CYC-B和CRTR-B2。這些基因都是枸杞類胡蘿卜素上游的生物合成基因。其中PSY1、CYC-B和CRTR-B2是有色體特異性的類胡蘿卜素生物合成基因,表明寧夏枸杞果實中明顯存在一條有色體特異性的類胡蘿卜素合成途徑。此外,LCY-E和ZEP的低轉錄水平也正好解釋了寧夏枸杞果實中類胡蘿卜素的含量遠高于其他類胡蘿卜素類色素含量的原因[13]。

米佳等研究表明,成熟的寧夏枸杞主栽品種,其果實中類胡蘿卜素含量介于120～400 mg/100 g,是成熟黑果枸杞、黃果枸杞果實的312倍和9.7倍[8],不同種/變種枸杞的類胡蘿卜素組成差異較大,其中,黃果枸杞也富含類胡蘿卜素,富含游離玉米黃素,且具有不同的品種的黃果枸杞,其類胡蘿卜素總含量也存在顯著差異[8,14-15]。Mia Isabelle等分析的新加坡枸杞中的類胡蘿卜素成分的新黃質、紫黃質、葉黃素、玉米黃素和番茄紅素含量分別為82.04、89.43、91.42、4.39、0.19 μg/g[6]。因此,除黑果枸杞、寧夏枸杞外,黃果枸杞等其它種/變種在發育過程中,其類胡蘿卜素的合成途徑如何,尚需進一步研究。

圖1 枸杞類胡蘿卜素的化學結構圖(C72H116O4;CAS號:144-67-2)Fig.1 The chemical structure of Goji carotenoids(C72H116O4;CAS No.:144-67-2)

3 枸杞類胡蘿卜素類成分功效作用研究

3.1 抗氧化活性

類胡蘿卜素作為一種營養性抗氧化劑,在動物和人體細胞中,其抗氧化損傷機制主要是有兩個,一個是猝滅單線態氧和以熱的形式散失能量,二是消除自由基以阻礙或終止反應鏈的進行[16]。有關類胡蘿卜素抗氧化作用報道較多。枸杞總類胡蘿卜素含量最高,其鮮果類胡蘿卜素含量分別是常見果蔬的3～242倍,寧杞1號干果的類胡蘿卜素提取物總抗氧化能力和FRAP值最高,分別是其它果蔬材料類胡蘿卜素提取物總抗氧化能力的7.04～86.28倍,FRAP值的2.46～23.17倍[15]。ABTS+自由基清除力、FRAP值與總類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關(p<0.01,相關系數分別為0.97和0.715)[14]。可見,不同來源的枸杞類胡蘿卜素活性差異較大。枸杞中主要的類胡蘿卜素為玉米黃素(zeaxanthin,3,3′-二羥基-β-胡蘿卜素)、β-胡蘿卜素和β-隱黃質(β-cryptoxanthin)的棕櫚酸酯化衍生物,而枸杞各類胡蘿卜素組成抗氧化活性差異性、各化學組分及抗氧化活性構效關系有待于進一步探討闡明。

3.2 肝保護作用

Kim等[17-18]報道中華枸杞類胡蘿卜素能夠顯著抑制體外培養的大鼠(Rattusnorvegicus)Ito細胞攝取胸苷和合成膠原的能力,并緩解由四氯化碳引起的Kupffer細胞炎癥反應和氧化應激損傷。枸杞類胡蘿卜素的保護能力與水飛薊素(silybin)相當。在膽總管結扎(bile duct ligation,BDL)制備大鼠繼發性膽汁淤積性肝纖維化模型中,連續6周每日口服25 mg/kg的枸杞類胡蘿卜素后,大鼠的一般性肝損傷、肝纖維化程度和肝內氧化應激壓力均得到了相當程度的緩解[19]。 Xiao等利用大鼠慢性酒精性脂肪肝模型研究了枸杞類胡蘿卜素作用效果,結果表明,枸杞類胡蘿卜素能夠通過調控MAPK通路顯著改善肝臟損傷[20]。臨床上,在干細胞培養基中預處理0.5 mol·L-1枸杞類胡蘿卜素2 h可以顯著提高人源脂肪間充質干細胞在體外抵抗氧化應激/炎癥損傷的能力以及治療急性肝衰竭細胞移植的效率,其主要分子機制是通過Raf1/MAPK通路精確調控microRNA-210的表達水平。若microRNA-210的表達過低或過高,均會影響干細胞抵抗逆境的能力和移植治療肝病的效率[21]。

3.3 眼保健功效

眼保健功效是類胡蘿卜素物質主要的功效作用之一。目前研究表明,除了結構相似的β-胡蘿卜素和β-隱黃質在體內可轉化為維生素A,發揮眼保健作用外[22],玉米黃素與其同分異構體葉黃素在子宮內和整個生命周期的眼部發育中起著重要作用,表現為降低年齡相關眼病發展的風險[23]。究其機理在于,除了玻璃體、角膜和鞏膜外,幾乎所有的人眼結構都含有葉黃素、玉米黃素和其代謝產物[24]。最高濃度的葉黃素和玉米黃素在眼睛的視網膜黃斑中，在黃斑中心凹處,葉黃素和玉米黃素的濃度比眼睛其他部位高出100倍[25]。葉黃素和玉米黃素在眼部不同部位含量的差異性表明,它們可能發揮不同的主要生理功能。目前研究的主要功能有五方面:第一,黃斑類胡蘿卜素吸收40%～90%的入射藍光(取決于濃度)從而保護視網膜免受光損傷[26-28];第二,作為抗氧化劑,保護眼部視網膜色素上皮(RPE)、晶狀體、睫狀體和虹膜等組織的氧化損傷[24,29];第三,抗炎作用,葉黃素通過防止氧化誘導的細胞因子和炎癥相關基因的上調表達的增加和通過間接補體激活途徑的限速酶D因子的減少,減緩眼部炎癥[30-32];第四,細胞間通訊等作用[33-34]。枸杞具有眼保健作用,其提取物具有延遲人類視網膜上皮細胞病變的作用[35]。每日飲食補充枸杞漿果90 d可以增加血漿玉米黃素和抗氧化水平,并保護老年人黃斑中色素沉著減少和軟性玻璃疣累積[36]。但有關直接應用枸杞類胡蘿卜素進行眼保護功效的相關研究鮮見。

3.4 生物利用度研究

諸多研究通過葉黃素和玉米黃素視網膜組織積累,研究其生物利用度。高效液相色譜法和非侵入性評估尸體解剖組織中的葉黃素和玉米黃素積累水平研究結果均表明,葉黃素和玉米黃素積累在個體之間變化差異顯著。大量證據表明,飲食、代謝和遺傳影響對葉黃素和玉米黃素在血液中的運輸和眼中的積累、吸收均具有影響[37]。枸杞中主要的類胡蘿卜素成分為棕櫚酸酯化的玉米黃素,關于其生物利用度研究報道較少。恒河猴(Macacamulatta)連續服用枸杞子提取物6周后(每日約2 mg枸杞類胡蘿卜素),血漿、肝臟、腎臟、黃斑中玉米黃素的含量相較對照組均有顯著上升,而大腦中的含量并未有顯著變化[38]。而另一項針對人類的研究發現,當受試者服用一次(5 mg)來自寧夏枸杞的3R,3′R-枸杞類胡蘿卜素后9～24 h血漿中該化合物達到峰值,說明酯化的枸杞類胡蘿卜素比非酯化形式的枸杞類胡蘿卜素生物利用率更高[39]。Chung等[40]研究發現,健康志愿者連續28 d服用寧夏枸杞干果后,其血漿中玉米黃素的濃度比對照組高出2.5倍。且研磨過的枸杞子與熱牛奶(80 ℃)共同服用后,其玉米黃素的生物利用率要顯著高于與熱水(80 ℃)共同服用的方式[41]。因此,推測枸杞類胡蘿卜素在生物體中發揮作用的單體可能是脫去雙棕櫚酸基團的玉米黃素,且受飲食的影響。但是有關其體內代謝和生物利用的具體途徑及相關機制還需要進一步深入研究。

4 枸杞類胡蘿卜素的分析、分離制備研究

4.1 枸杞類胡蘿卜素的分析方法研究

在分析方法上,枸杞類胡蘿卜素主要采用分光光度計和HPLC法。游離型類胡蘿卜素及其酯化衍生物極性小,除了類胡蘿卜素糖苷化衍生物外,難以用常見的C18反相柱分離,故多數研究者采用C30柱分析、分離枸杞中該類化合物,并通過HPLC-DAD-APCI/MS等手段定性或定量分析枸杞子中這類成分[8]。隨著枸杞類胡蘿卜素化合物的逐漸明確,采用HPLC結合標準品即達到有效的分析目的。但由于該類化合物的極性小的原因,其粗提物提取及HPLC洗脫溶劑主要是己烷、丙酮、石油醚、四氫呋喃、甲基叔丁基醚、二氯甲烷等[7-9],這些溶劑均具有不同程度的毒性。但傳統方法不僅步驟繁瑣,且操作過程中有機溶劑對人體的傷害較大。限制了枸杞類胡蘿卜素的提取分離及其進一步的深加工利用。

米佳等[8]建立了一種枸杞玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的快速判斷方法。即利用枸杞顏色特征值估算其玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的系數模型。首先,采用柯尼卡美能達CM-5分光測色儀進行枸杞顏色特征分析,測定時每個枸杞樣品選取5個果實,以白色校正瓷磚為背景,測量枸杞表面亮度(L)、紅度(a)和黃度(b),根據式(1)、(2)計算c值和h值。

式(1)

式(2)

然后,根據所得鮮果枸杞的表皮顏色值L(X1),a(X2),b(X3),c(X4),h(X5),及所建回歸方程Y=-582.221+0.739X1+8.028X2-0.379X3+0.452X4+0.032X5(p=0.006,擬合值R=0.993),估算枸杞中主要化合物玉米黃素雙棕櫚酸酯(Y)的含量[8]。

4.2 枸杞類胡蘿卜素的提取制備研究

基于枸杞類胡蘿卜素總體上以極性小的脂溶性化合物為主的原因,其提取制備工藝近年來從溶劑法到超臨界萃取過渡發展。周學義輔以乙醇為夾帶劑,獲得了從枸杞、枸杞渣粕中提取玉米黃質的超臨界萃取方法[42]。牛東玲、安紹芳獲得了200 g原料的枸杞脂溶性色素的超臨界小量制備工藝:分離壓力為5～11 MPa,分離溫度為30～50 ℃。所得脂溶性成分為β-胡蘿卜素、β-隱黃質和玉米黃素[43]。但枸杞富含小分子糖(主要是果糖和葡萄糖),在萃取溫度達到35～45 ℃時,造成萃取后料渣黏在一起,且堅硬無比地粘在萃取釜中,無法取出,致使損壞萃取釜。生產規模越大,該現象越嚴重。而且,目前我國主要栽種寧夏枸杞的寧杞1號、寧杞7號等品種,主要的類胡蘿卜素組分為玉米黃素雙棕櫚酸酯,本課題組采用降糖等工藝,先將枸杞降糖,使枸杞原料總糖含量從41%～45%降低至25%～29%,水含量從11%～12%降低至8%～10%,并保留原料和料渣中的多糖含量仍然≥1.5%。然后取10kg烘干后粉碎至100目,置于超臨界萃取釜中,進行萃取,然后合并收集0.6～3 h萃取物,萃取物玉米黃素雙棕櫚酸酯純度達80%以上。該技術參數適應于中試放大生產[44]。

4.3 枸杞類胡蘿卜素深加工產品研發

目前85%以上的枸杞是以干果形式進行市場流通的。Ma等研究表明,制干對枸杞類胡蘿卜素的穩定性具有影響,玉米黃質二棕櫚酸酯在干燥過程中含量有不同程度的下降,并對生產外觀有影響[45]。一方面,作為枸杞主要的功效成分之一,枸杞類胡蘿卜素具有潛在的多種生理學功能和保健價值;另一方面,研究主要集中在遺傳代謝途徑、分析測定方法方面,在枸杞類胡蘿卜素深加工方面研究和開發應用鮮見,僅在部分的枸杞籽油的保健產品中,少量含有。究其原因,作者認為,除了枸杞類胡蘿卜素中的玉米黃素雙棕櫚酸酯的功效作用及其體內代謝途徑等相關機理需要進一步發掘,枸杞類胡蘿卜素的穩定性和活性保持技術、提取分離新技術及加工過程中副產物的綜合利用成為其進一步深加工利用的關鍵。

5 展望

枸杞類胡蘿卜素含量和組成較復雜,不同種/變種及品種之間含量及組成差異較大。系統地闡明不同種/變種及品種枸杞類胡蘿卜素的合成機制有利于進一步發掘枸杞功能基因的有效利用;同時,除了枸杞類胡蘿卜素中的玉米黃素雙棕櫚酸酯的功效作用及其體內代謝途徑等相關機理需要進一步發掘外,加強枸杞類胡蘿卜素的穩定性和活性保持技術、提取分離生產技術研究與開發、集成技術研發枸杞類胡蘿卜素保健產品,并對加工過程中副產物進行綜合利用,將有利于枸杞物質功效成分的深加工利用和枸杞產業的進一步可持續發展。