源于廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌無毒基因型分析

汪文娟，蘇菁，楊健源，韋小燕，陳凱玲，陳珍，陳深，朱小源

?

源于廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌無毒基因型分析

汪文娟，蘇菁，楊健源，韋小燕，陳凱玲，陳珍，陳深，朱小源

（廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640）

【目的】分析源于廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌（）無毒基因型，為華南不同主栽抗病水稻品種的合理布局提供參考依據。【方法】利用抗稻瘟病單基因系，對稻瘟病菌單孢分離菌株進行致病型測定；并根據已克隆的且與稻瘟病菌致病性相關的8個無毒基因功能性分子標記進行分離菌株的無毒基因型分析。選取分離自廣8 A雜交稻組合的27個稻瘟病菌單孢菌株，提取各菌株的菌絲體DNA作為模板，進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測。并對其中的7個稻瘟病菌菌株進行相應無毒基因全長或CDS區域的PCR產物測序，將測序序列與相應無毒菌株的無毒基因序列進行比較分析。【結果】所測定的菌株對其中的5個單基因系IRBLkh-K3()、IRBLb-B()、IRBLz5-CA()、NIL-e1（）和IRBL9-W()表現高的無毒性頻率（＞85%），所有菌株對單基因系IRBL9-W()和NIL-e1（）都表現無毒；這些菌株對其中的7個單基因系表現較低的無毒性頻率（＜20%），包括IRBLks-F5()、IRBLa-A()和IRBL19-A()等，表明分離自廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌對不同的單基因系表現出不同的致病型。所有菌株都被檢測出含無毒基因和，并可檢測到無毒基因的2種類型：-D型和-E型，但未檢測出無毒基因、和。在部分菌株中能檢測到無毒基因、和預期大小的產物，但在所檢測的菌株中均以較低的頻率與不同的突變類型出現。對GD13-621、GD14-349與GD15-291等7個菌株分別進行相應無毒基因的PCR產物測序，、及的基因序列與其各自無毒菌株的無毒基因序列完全一致，表明分離菌株中這3個無毒基因的基因結構相對穩定。測序菌株的基因序列與已報道的無毒菌株的序列在基因的上游區域存在2個SNP的差異及3個連續堿基的插入，具有較豐富的多樣性；6個測序菌株的基因序列高度一致，僅在編碼區存在1個SNP的差異即136（C/A），該位點SNP的變異導致氨基酸的錯義突變46（H/N），表現為菌株攜帶-D或-E型。【結論】在華南主栽品種廣8 A雜交稻組合上分離的稻瘟病菌中和分布較為廣泛，在上述品種感病區域，可選用含和的抗病品種作為輪換種植。

雜交稻組合；廣8 A；稻瘟病菌；無毒基因；抗稻瘟病單基因系

0 引言

【研究意義】水稻（）是世界上最重要的糧食作物之一，全球一半以上的人口以稻米作為主食[1]。由稻瘟病菌（；無性態：）引起的稻瘟病是全球水稻生產上最具毀滅性的病害之一[2]，嚴重威脅著糧食產量，每年由該病害引起的水稻產量損失高達10%—30%，嚴重時甚至顆粒無收[3-5]。培育和種植抗病品種是控制該病害最經濟與環保的措施[6-7]。以野敗型優質秈稻不育系廣8 A配組選育的廣8優165、廣8優169和廣8優2168等雜交稻組合，是華南稻區近年來廣泛推廣種植的優質雜交稻組合[8]。隨著該系列組合的連續大面積推廣種植，其抗瘟性逐漸下降。探明侵染廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌無毒基因類型及其變異情況，可為該稻區抗病品種的輪換及新品種的選育提供科學依據。【前人研究進展】水稻對稻瘟病菌的抗性符合“基因對基因”學說，即在水稻品種中存在一個抗性基因，在稻瘟病菌中也對應存在一個無毒基因[9]；只有在稻瘟病菌的無毒基因與寄主抗性基因相互作用的前提下，水稻品種才表現出抗瘟性[10-11]。近年來，在水稻抗瘟基因和稻瘟病菌無毒基因的鑒定與分析方面，取得了重要的研究進展。目前，已有、、、、、、、、、、及等12個無毒基因完成了克隆[12-15]。并且，根據已克隆無毒基因的序列信息開發特異性分子標記，在鑒定稻瘟病菌群體中無毒基因的類型與變異方面已有大量的研究報道。李祥曉等[16]利用7個稻瘟病菌無毒基因的特異性引物，對177個來自黑龍江省的稻瘟病菌單孢菌株進行PCR檢測，結果表明7個無毒基因以不同的出現頻率在黑龍江省不同地區均有分布；王世維等[17]利用6個已克隆無毒基因分子標記，對遼寧省26個稻瘟病菌單孢菌株進行PCR檢測及無毒基因PCR產物測序分析，結果表明在遼寧稻區稻瘟病菌中、和分布相對廣泛；朱名海等[18]利用6個無毒基因分子標記對南繁區稻瘟病菌無毒基因的分布情況進行分析，結果表明除了無毒基因在南繁非核心區的稻瘟病菌株中未檢測到外，其他5個無毒基因在所檢測的稻瘟病菌中均存在，其中無毒基因的分布頻率為100%。另一方面，隨著國內外水稻抗稻瘟病近等基因系和單基因系的育成，國內學者已開始利用這些單基因系鑒別系統開展稻瘟病菌致病小種變異的研究[19-22]。【本研究切入點】深入闡明分離自主栽品種稻瘟病菌小種的變異特征，需要從病原菌致病性變異和無毒基因型分析兩方面開展研究。為準確探明侵染華南主推品種廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌所攜帶的無毒基因類型及變異情況，本研究結合抗病單基因系品種致病性鑒定和已知無毒基因的擴增和測序，對采集自廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌進行分析，研究不同菌株中無毒基因的類型及其變異情況。【擬解決的關鍵問題】通過25個稻瘟病抗性單基因系對采集自廣8 A雜交稻組合的27個稻瘟病菌株進行致病型測定；根據8個已克隆無毒基因（、、、、、及）功能性分子標記的檢測，明確源自廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌無毒基因或其等位基因的存在/缺失情況，并對擴增的無毒基因產物進行測序，比較分析測序菌株間無毒基因序列的變異特征；比較分離自廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌菌株與其他來源菌株的無毒基因類型，為華南稻區抗瘟品種的合理布局與稻瘟病的有效控制提供依據。

1 材料與方法

試驗于2017年在廣東省農業科學院植物保護研究所試驗基地完成。

1.1 病原菌材料、繁殖及產孢

病原菌來源：2012—2016年，從廣東不同稻區的雜交稻主導品種廣8 A雜交稻組合上采集穗頸瘟病樣，從中分離純化稻瘟病菌菌株。

田間采集的穗頸瘟標樣，用0.5%的強氯精消毒2 min，隨后用無菌水清洗，置于滅菌的培養皿中保濕培養約3 d，利用孢子振落法進行病原菌株的單孢分離。共分離獲得稻瘟病菌單孢菌株41個（表1），所有菌株保存于廣東省農業科學院植物保護研究所。

表1 41個稻瘟病菌菌株及其來源

菌株活化及產孢：將保存的菌株轉移至酵母固體培養基，25℃左右的生化培養箱中活化培養7 d以上；然后將菌絲體轉接到玉米培養基上繁殖，25℃左右培養約13 d。用消毒過的無菌水洗去玉米粒表面的菌絲，將玉米粒置于消毒的搪瓷盤中（25 cm×19 cm×2 cm），上面覆蓋一層濕紗布，然后在日光燈下光照培養3—4 d，進行產孢。

1.2 致病型測定

植物材料：25個抗稻瘟病單基因系分別為IRBLa-A（）、IRBLi-F5（）、IRBLks-F5（）、IRBLk-Ka（）、 IRBLkp-K60（）、IRBLkh-K3（）、IRBLz-Fu（）、IRBLz5-CA（）、IRBLzt-T（）、IRBLta-K1（）、IRBLb-B（）、IRBLt-K59（）、IRBLsh-S（）、IRBL1-CL（）、IRBL3-CP4（）、IRBL5-M（）、IRBL7-M（）、IRBL9-W（）、IRBL12-M（）、IRBL19-A（）、IRBLkm-Ts（）、IRBL20-IR24（）、IRBLta2-Re（Pita）、IRBL11-Zh（）、NIL-e1（），其中NIL-e1是Zhu等[23]以麗江新團黑谷為背景，經過6次回交及6次自交發展而成；含0的抗稻瘟病近等基因系，由廣東省農業科學院植物保護研究所選育，其余單基因系由國際水稻研究所選育。感病對照：麗江新團黑谷（LTH）。

植物材料種植：將水稻種子催芽后穴播于30 cm×20 cm×5 cm規格的搪瓷盆里，每盆播25個材料，每個材料播種量約為10粒種子。稻苗采取旱育栽培，長至1葉1心期用硫酸銨施肥，每盆施肥量為0.5 g，接種前共需施肥3次。待稻苗長至3.5—4葉齡時，進行人工噴霧接種。

接種及調查：用無菌水洗下玉米粒上的孢子，用2層塑料細紗網隔去除玉米殘渣，配成適量濃度的孢子液，一般將孢子液濃度調至1×105個/mL，進行人工噴霧接種。接種后置于遮光密閉的培養箱中暗培養，在25℃及相對濕度達95%以上的條件下保濕24 h，之后轉至玻璃溫室，在25—28℃下保濕培養至稻苗發病，一般在接種7 d左右觀察稻苗的整體發病情況進行調查。病級調查方法按照國際水稻研究所稻瘟病圃苗瘟分級標準進行：0—3級為抗（R）；4—9級為感（S）。

1.3 稻瘟病菌DNA的提取

將分離純化的稻瘟病菌單孢菌株在CM（完全培養基）固體培養基上活化培養，挑取適量菌絲塊接到CM液體培養基中，于28℃搖床，160 r/min振蕩培養3—5 d，收集菌絲體；用Omega公司的真菌DNA抽提試劑盒，提取菌絲體的基因組DNA。

1.4 無毒基因分子標記檢測

引物設計：8個已克隆稻瘟病菌的無毒基因（、、、、、、、）中，的特異引物根據GenBank中基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設計；其他7個無毒基因的特異引物參照Selisana等[24]開發的序列。所有引物都在生工生物工程（上海）股份有限公司（廣州生工）合成。引物序列詳見表2。

無毒基因分子標記檢測：PCR反應總體積為20 μl，其中包括稻瘟病菌基因組DNA（20—30 ng·μl-1）1 μl；10×PCR Mixture10 μl，正、反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μl，ddH2O 8 μl。PCR擴增程序：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56—60℃（根據不同引物而定）退火30 s，72℃延伸1 min/kb，共設置35次循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物于1%—1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

1.5 部分無毒基因序列測序分析

利用高保真酶KOD-Plus（東洋紡，日本）進行PCR擴增，并對產物進行目的片段的純化，將純化的PCR產物送到廣州英濰捷基公司進行測序。采用Lasergene 7.0軟件中的SeqMan（http://www.dnastar.com/）進行全部測序序列的比對與拼接；并采用DNAStar MegAlign ClustalV軟件對有差異的核苷酸序列進行比較分析。

2 結果

2.1 分離自廣8優組合的菌株致病型

利用25個水稻抗稻瘟病單基因系和感病對照品種麗江新團黑谷，對其中采集自廣8 A雜交稻組合的27個稻瘟病菌株進行致病型測定。結果表明，這些菌株對25個單基因系的無毒性頻率具有豐富的多樣性（表3）。所測定的菌株對其中的5個單基因系NIL-e1（）、IRBL9-W（）、IRBLz5-CA （）、IRBLkh-K3（）和IRBLb-B（）表現高無毒性頻率（＞85%）；其中，所有菌株對單基因系NIL-e1（）和IRBL9-W（）均表現無毒。然而，這些菌株對其中的7個單基因系IRBLt-K59（）、IRBL12-M（）、IRBLks-F5（）、IRBLa-A（）、IRBL3-CP4（）、IRBL11-Zh（）、IRBL19-A（）表現相對較低的無毒性頻率（＜20%）。上述結果表明，分離自廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌對不同的抗瘟單基因系表現出不同的致病型。

表2 本研究中用于檢測無毒基因的引物

2.2 稻瘟病菌8個無毒基因在廣8優組合分離菌株中的單倍型

為了確定試驗菌株中8個已克隆無毒基因的單倍型，利用Selisana等[24]開發的7個無毒基因的分子標記及本文設計開發的分子標記（表2），通過PCR擴增，對27個供試菌株進行無毒基因單倍型分析。部分菌株無毒基因的PCR擴增結果如圖1所示。在27個供試菌株中均能檢測到無毒基因的片段；有26個菌株能檢測到-CDE基因片段，其中經-D型引物檢測，有12個菌株能檢測到-D型。相反地，在任何菌株中都擴增不到、和。無毒基因和在所檢測的27個菌株中可擴增出3種帶型：擴增預期大小的條帶、無擴增條帶和有轉座子插入的條帶，但只在其中的4個菌株中檢測到預期大小的目的基因片段。無毒基因在所檢測的27個菌株中可擴增出2種帶型：擴增預期大小的條帶和無擴增條帶，僅在其中的3個菌株中檢測到預期大小的片段。

M：Marker，DL2000；CK：陰性對照（ddH2O）Negative control (ddH2O)；1—15：部分試驗菌株的DNA Some DNA samples of test strains

對GD13-621、GD13-3024、GD14-349、GD14-493、GD15-291、GD15-506與GD16-3071等7個菌株進行相應無毒基因全長或CDS區域的PCR產物測序，該7個菌株分別能檢測到、、、或等無毒基因。結果表明，所測序7個菌株的基因編碼區序列和5個測序菌株包含啟動子區的基因序列，與其各自無毒基因的序列完全一致（Genbank登錄號分別為KM004023和EU837058）；3個菌株包含啟動子區的基因編碼區序列與參照序列無差異（Genbank登錄號為AF207841.1）。然而，3個菌株的基因序列與參照的序列（Genbank登錄號KM887844.1）相比，在基因的上游區域存在2個SNP的差異及3個連續堿基的插入，其中菌株GD16-3071比較特殊，存在連續6個堿基的插入（圖2-A）；6個菌株僅在編碼區存在1個SNP的差異即136（C/A），導致氨基酸的錯義突變46（H/N），表現為菌株攜帶-D或-E型；菌株GD13-621和GD14-349在該位點出現了雙峰的現象，可能這2個菌株中同時含有-D型和-E型基因（圖2-B）；在同一個菌株中同時存在-D型和-E型的情況，在Yoshida等[12]的文中未見報道。

2.3 稻瘟病菌中Avr基因的存在與各自R基因致病型間的相關性

稻瘟病菌菌株中無毒基因的存在與相應抗病基因致病型間的相關性分析，是基于無毒基因特異性分子標記確定稻瘟病菌致病譜的重要基礎。將無毒基因分子標記檢測的稻瘟病菌無毒基因型與抗稻瘟病單基因系分析的病原菌致病型進行比較，結果表明所檢測的27個菌株都含有無毒基因，并且在致病型監測試驗中，這27個菌株對含的抗瘟單基因系IRBL9-W都顯示無毒性。含有無毒基因的菌株對其相應的抗瘟單基因系IRBLzt-T也都表現無毒性；然而，一些含和的菌株卻能侵染其對應的抗病基因單基因系。另外，有些不含有相應無毒基因的菌株對IRBLi-F5和IRBLa-A單基因系顯示無毒性（如GD13-3009、GD13-632和GD15-315等）；有4個菌株（GD14-366、GD15-315、GD16-272和GD16-280）不含有對應的無毒基因，卻對其中的4—5個抗瘟單基因系IRBLi-F5、IRBLzt-T、IRBLta-K1、IRBLb-B或IRBLa-A表現出一致的無毒性（表4）。

2.4 源自廣8 A雜交稻組合以及其他主栽品種的稻瘟病菌無毒基因型比較

為了進一步比較源自廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌菌株與其他品種來源菌株致病性的差異，選取25個抗性單基因系中的11個品種對源自廣8優組合的41個菌株進行致病性測定。這11個品種所含的抗病基因常見于華南稻區水稻品種中。結果表明，所測試的41個菌株對11個抗稻瘟病單基因系的致病性具有豐富的多樣性，對其中的4個單基因系IRBL9-W（）、NIL-e1（）、IRBLkh-K3（）及IRBL1-CL（）表現高的無毒性頻率（＞92%），相反地，對其中的2個單基因系IRBLzt-T（）和IRBLta2-Re（Pita）表現較低的無毒性頻率（＜40%）（表5）。

將11個抗稻瘟病單基因系鑒別品種對源自常規稻粵晶絲苗2號、雜交稻五優308和本研究的廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌致病型分析進行比較，結果表明分離自廣8 A雜交稻組合、粵晶絲苗2號[21]和五優308[22]的菌株對其中的3個單基因系IRBL9-W（）、IRBLkh-K3（）和IRBL1-CL（）表現出一致的較高無毒性頻率（＞88%）；對其中的1個單基因系IRBLta2-Re（Pita）表現出一致較低的無毒性頻率（＜40%）。另外，不同來源菌株間的致病性存在一定的差異，分離自粵晶絲苗2號的菌株對含抗病基因與單基因系的無毒基因頻率高達100%，但所測試的菌株可以侵染含抗病基因、、及的單基因系；分離自五優308的菌株對含抗病基因、和的無毒基因頻率達83%以上，但所測試菌株都能侵染含的單基因系；分離自廣8 A雜交稻系列組合的菌株對含抗病基因的無毒基因頻率較低（26.83%）（圖3）。

表5 41個菌株對11個抗稻瘟病單基因系的致病性

圖2 測序菌株的序列與參照AvrPib或AvrPik序列比對

3 討論

3.1 無毒基因監測與品種布局

近年來，水稻稻瘟病在華南稻區區域性或間歇性暴發成災，多次出現一個或幾個品種在部分稻區稻瘟病暴發，造成糧食的大面積減產甚至絕收[22,25]。監測本地區主栽水稻品種稻瘟病菌無毒基因的類型及發生情況，可為抗病品種在基因型水平上的合理布局與利用提供科學依據。

侵染華南不同主栽品種的稻瘟病菌無毒基因型具有共性及差異性。分離自粵晶絲苗2號、五優308和廣8優組合的稻瘟病菌對單基因IRBL9-W（）、IRBLkh-K3（）和IRBL1-CL（）表現出一致的高無毒性頻率（＞88%），對單基因系IRBLta2-Re（Pita）和IRBLi-F5（）表現出較低的無毒性頻率（＜40%）；分離自廣8優組合的稻瘟病菌對單基因系NIL-e1（）均表現無毒，分離自粵晶絲苗2號的稻瘟病菌不侵染含抗病基因及單基因系，分離自五優308的稻瘟病菌對含抗病基因的品種呈現較高的無毒性頻率。在上述3類品種均感病的稻區，可以布局含、或的抗病品種，而上述品種由于其無毒基因型存在一定的差異，可考慮在同一稻區進行輪換使用，以減輕病原菌無毒基因型單一化的選擇壓力。前人研究表明，抗瘟基因與在我國水稻育種上具有重要的應用價值，Zhu等[23]對抗瘟基因的研究表明，該基因對華南地區稻瘟病菌表現出廣譜抗性；李進斌等[26]分析了22個抗病基因在云南3個稻區的抗性，表明和在該3個稻區具有良好的抗性；張國民等[27]分析了24個抗病基因在我國寒地稻區的抗性，表明對該稻區的稻瘟病菌具有廣譜抗性。因此，含或的水稻品種抗瘟性好，可與廣8 A雜交稻組合進行輪換使用。

圖3 源自不同水稻品種的稻瘟病菌無毒基因頻率比對

3.2 無毒基因變異機制

“植物-病原菌”的相互作用是兩者協同進化的主要推動力[28]，目前存在兩種寄主與病原菌的進化機制，即“軍備競賽”和“陣地戰模式”機制[29]。無毒基因與等位基因間呈現競爭性的階梯型共進化模式[30]，該基因的突變主要是編碼區單堿基的突變引起氨基酸的變異。在本研究中檢測到了已報道的-D型和-E型等位基因，其中-D型可被抗病基因、和所識別；-E型可被抗病基因、和識別[30]。本研究在26個菌株中都能檢測到-CDE基因片段，利用-D型引物在其中的12個菌株能檢測到-D型；說明含、、及其等位基因的水稻品種可抵御侵染廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌。汪文娟等[31]在華南雜交稻裕優132、恒豐優華占、吉豐優華占等組合中分別檢測到或；這些品種可與廣8 A雜交稻組合在生產上輪換使用。

無毒基因等位基因在華南稻區所受的自然選擇壓較強，致使華南稻區等位基因具有豐富的遺傳多樣性；且從華南到東北的出現頻率逐漸增加[13]。在本研究中，在所檢測的27個菌株中可擴增出3種帶型：擴增預期大小的條帶、無擴增條帶和有轉座子插入的條帶；但分別只在其中的4個菌株中檢測到預期大小的目的基因片段；且其序列與已克隆的無毒基因在基因編碼區的上游存在SNP或幾個堿基的缺失，證明具有較強的變異能力，遺傳多樣性豐富，與前人的研究結果相符[13]。

3.3 無毒基因型分析

基于抗稻瘟病單基因系的苗期致病性分析，結合已克隆無毒基因對病原菌的單倍型監測，可有效地用于稻瘟病菌群的致病譜分析及水稻品種有效抗病基因的推斷[16,32]。據報道，利用不同遺傳背景的品種創建的抗稻瘟病單基因系，其鑒定結果受不同品種的影響較大[33]。基于無毒基因型分子標記的診斷，可對抗稻瘟病單基因系鑒定結果進行科學的補充。本研究利用水稻抗稻瘟病單基因系和無毒基因分子標記對病原菌進行了無毒基因型分析，發現個別單基因系的檢測結果與無毒基因標記檢測的結果存在差異，如有4個菌株（GD14-366、GD15-315、GD16-272和GD16-280）不含有對應的無毒基因，卻對其中的4—5個抗瘟單基因系表現出一致的無毒性；推斷存在2種可能的原因：一種是物理原因，可能是PCR擴增效果、植株生長情況或接種效果不理想等；另一種是品種內在原因，這2個抗瘟單基因系可能含有其他未知功能的抗瘟基因。從抗稻瘟病單基因系鑒定及無毒基因型分子鑒定水平了解稻瘟病菌無毒基因的類型，從而推斷水稻品種的抗瘟基因型，可為水稻品種的合理布局與抗瘟基因的有效利用提供重要的參考；并可對相應稻區稻瘟病的流行進行有效預警，為稻瘟病的及時防控提供科學的理論依據，從而避免稻瘟病的大暴發。

4 結論

抗稻瘟病單基因系致病型監測顯示，含抗瘟基因、和的單基因系對分離自廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌菌株具有較高的抗病性，無毒基因與在侵染廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌中分布較為廣泛；且在該組合種植區的稻瘟菌群體中遺傳結構穩定，推廣含或的水稻品種可減輕稻瘟病的發生。分離自粵晶絲苗2號、五優308和廣8 A雜交稻組合的稻瘟病菌間具有不同的無毒基因類型及頻率，這3個品種或組合感病區域適合種植含或或的品種。其中，在廣8優組合感病的區域，可輪換種植粵晶絲苗2號和五優308；在粵晶絲苗2號感病的種植區，可輪換種植與廣8 A雜交稻組合及五優308抗瘟基因類型相近的品種。

[1] GNANAMANICKAM S S. Rice and its importance to human life//. Springer Science+Business Media B.V., 2009: 1-11.

[2] COUCH B C, KOHN L M. A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species,, from., 2002, 94(4): 683-693.

[3] SKAMNIOTI P, GURR S J. Against the grain: safeguarding rice from rice blast disease., 2009, 27(3): 141-150.

[4] MIAH G, RAFII M Y, ISMAIL M R, PUTEH A B, RAHIM H A, ASFALIZA R, LATIF M A. Blast resistance in rice: a review of conventional breeding to molecular approaches., 2013, 40(3): 2369-2388.

[5] CHOI J, PARK S Y, KIM B R, ROH J H, OH I S, HAN S S, LEE Y H.Comparative analysis of pathogenicity and phylogenetic relationship inspecies complex., 2013, 8(2): e57196.

[6] Ashkani S, Rafii M Y, Shabanimofrad M, Miah G, Sahebi M, Azizi P, Tanweer F A, Akhtar M S, Nasehi A. Molecular breeding strategy and challenges towards improvement of blast disease resistance in rice crop., 2015, 6: Article 886.

[7] TANWEER F A, RAFII M Y, SIJAM K, RAHIM H A, AHMED F, LATIF M A. Current advance methods for the identification of blast resistance genes in rice., 2015, 338(5): 321-334.

[8] 梁世胡, 李傳國, 李銳, 李曙光, 顧海永, 張其文. 增城絲苗型水稻優質不育系廣8A的選育. 雜交水稻, 2010, 25(6): 8-10, 40.LIANG S H, LI C G, LI R, LI S G, GU H Y, ZHANG Q W. Breeding of Zengchengsimiao-type fine quality CMS line Guang 8A in rice., 2010, 25(6): 8-10, 40. (in Chinese)

[9] FLOR H H. Current status of the gene-for-gene concept., 1971, 9: 275-296.

[10] MARCEL S, SAWERS R, OAKELEY E, ANGLIKER H, PASZKOWSKI U. Tissue-adapted invasion strategies of the rice blast fungus., 2010, 22(9): 3177-3187.

[11] LIU W D, ZHOU X Y, LI G T, LI L, KONG L G, WANG C F, ZHANG H F, XU J R. Multiple plant surface signals are sensed by different mechanisms in the rice blast fungus forformation., 2011, 7(1): e1001261.

[12] YOSHIDA K, SAITOH H, FUJISAWA S, KANZAKI H, MATSUMURA H, YOSHIDA K, TOSA Y, CHUMA I, TAKANO Y, WIN J, KAMOUN S, TERAUCHI R. Association genetics reveals three novel avirulence genes from the rice blast fungal pathogen., 2009, 21(5): 1573-1591.

[13] ZHANG S L, WANG L, WU W H, HE L Y, YANG X F, PAN Q H. Function and evolution ofavirulence generesponding to the rice blast resistance gene., 2015, 5: 11642.

[14] WU J, KOU Y J, BAO J D, LI Y, TANG M Z, ZHU X L, PONAYA A, XIAO G, LI J B, LI C Y, SONG M Y, CUMAGUN C J R C, DENG Q Y, LU G D, JEON J S, NAQVI N I, ZHOU B. Comparative genomics identifies theavirulence effectorthat triggers-mediated blast resistance in rice., 2015, 206(4): 1463-1475.

[15] RAY S, SINGH P K, GUPTA D K, MAHATO A K, SARKAR C, RATHOU R, SINGH N K, SHARMA T R. Analysis ofgenome reveals a fungal effector, which is able toinduce resistance response in transgenic rice line containingresistance gene,., 2016, 7: Article 1140.

[16] 李祥曉, 王倩, 羅生香, 何云霞, 朱苓華, 周永力, 黎志康. 黑龍江省稻瘟病菌無毒基因分析及抗病種質資源篩選.作物學報, 2012, 38(12): 2192-2197.LI X X,WANG Q,LUO S X,HE Y X,ZHU L H, ZHOU Y L,LI Z K. Analyzing avirulence genes offrom Heilongjiang province and screening rice germplasm with resistance to blast fungus., 2012, 38(12): 2192-2197. (in Chinese)

[17] 王世維, 鄭文靜, 趙家銘, 魏松紅, 王妍, 趙寶海, 劉志恒. 遼寧省稻瘟病菌無毒基因型鑒定及分析. 中國農業科學, 2014, 47(3): 462-472.WANG S W, ZHENG W J,ZHAO J M,WEI S H,WANG Y,ZHAO B H,LIU Z H. Identification and analysis ofavirulence genes in Liaoning province., 2014, 47(3): 462-472. (in Chinese)

[18] 朱名海, 趙美, 舒燦偉, 周而勛. 南繁區稻瘟病菌無毒基因的檢測. 華中農業大學學報, 2017, 36(4): 21-25.ZHU M H,ZHAO M,SHU C W,ZHOU E X. Detection of avirulence genes infrom South China Crop Breeding Area., 2017, 36(4): 21-25. (in Chinese)

[19] 周益軍, 程兆榜, 范永堅, 王金生, 陳毓苓, 張文薈. 用不同類型的水稻鑒別品種鑒定江蘇稻瘟病菌的致病性. 作物學報, 2003, 29(2): 268-273. (in Chinese)ZHOU Y J, CHENG Z B, FAN Y J, WANG J S, CHEN Y L, ZHANG W H. Study on the pathogenicity ofcollected from Jiangsu with four sets of differentials.,2003, 29(2): 268-273. (in Chinese)

[20] 蘭波, 楊迎青, 常冬冬, 徐沛東, 李湘民. 基于麗江新團黑谷的稻瘟病菌致病性分化. 華中農業大學學報, 2015, 34(1): 28-32.LAN B,YANG Y Q,CHANG D D,XU P D,LI X M.Pathogenicity differentiation of rice blast pathogen () based on Lijiangxintuanheigu., 2015, 34(1): 28-32. (in Chinese)

[21] 汪文娟, 蘇菁, 張杰, 李亦龍, 陳深, 曾列先, 楊健源, 朱小源. 源于粵晶絲苗2號穗瘟的稻瘟病菌致病性分析. 廣東農業科學, 2012(23): 59-61.WANG W J,SU J,ZHANG J,LI Y L,CHEN S,ZENG L X,YANG J Y,ZHU X Y. Pathogenicity analysis of the rice blast fungus isolated from the blast panicles of Yuejingsimiao 2., 2012(23): 59-61. (in Chinese)

[22] 汪文娟, 韋小燕, 陳凱玲, 陳尉芹, 陳珍, 楊健源, 朱小源. 源自雜交稻組合五優308稻瘟病菌致病性分析. 廣東農業科學, 2015(14): 70-73.WANG W J,WEI X Y,CHEN K L,CHEN W Q,CHEN Z,YANG J Y,ZHU X Y.Pathogenicity analysis onof hybrid combination Wuyou308., 2015(14): 70-73. (in Chinese)

[23] ZHU X Y, CHEN S, YANG J Y, ZHOU S C, ZENG L X, HAN J L, SU J, WANG L, PAN Q H. The identification of(t), a new member of the rice blast resistance/multigene family., 2012, 124(7): 1295-1304.

[24] SELISANA S M, YANORIA M J, QUIME B, CHAIPANYA C, LU G, OPULENCIA R, WANG G L, MITCHELL T, CORRELL J, TALBOT N J, LEUNG H, ZHOU B. Avirulence () gene-based diagnosiscomplementsexistingpathogen surveillance tools for effective deployment of resistance () genes against rice blast disease.,2017, 107(6): 711-720.

[25] 朱小源, 楊健源, 陳玉托, 楊維新, 陳喜勞, 曾列先, 陳深. 引致天優998抗性喪失的稻瘟病菌小種鑒定及其致病性測定. 廣東農業科學, 2008(12): 84-86.ZHU X Y,YANG J Y,CHEN Y T,YANG W X,CHEN X L,ZENG L X,CHEN S.Race identification and pathogenicity test of the blast fungus causing the resistance breakdown of hybrid rice Tianyou 998., 2008(12): 84-86. (in Chinese)

[26] 李進斌, 李成云, 陳艷, 雷財林, 凌忠專. 二十二個抗稻瘟病基因在云南的利用價值評價. 植物保護學報, 2005, 32(2): 113-119.LI J B,LI C Y,CHEN Y,LEI C L,LING Z Z.Evaluation of twenty-two blast resistance genes in Yunnan using monogenetic rice lines., 2005, 32(2): 113-119. (in Chinese)

[27] 張國民, 馬軍韜, 肖佳雷, 劉迎雪, 辛愛華, 任洋, 張麗艷, 劉東風. 已知抗瘟基因在黑龍江省寒地稻區的評價與利用. 植物病理學報, 2011, 41(1): 72-79.ZHANG G M,MA J T,XiAO J L,LIU Y X, XIN A H,REN Y,ZHANG L Y,LIU D F. Evaluation and utilization of value of twenty-four blast resistance genes in north cold region, Heilongjiang., 2011, 41(1): 72-79. (in Chinese)

[28] KANZAKI H, YOSHIDA K, SAITOH H, FUJISAKI K, HIRABUCHI A, ALAUX L, FOURNIER E, THARREAU D, TERAUCHI R. Arms race co-evolution ofand ricegenes driven by their physical interactions., 2012, 72(6): 894-907.

[29] WOOLHOUSE ME, WEBSTER JP, DOMINGO E, CHARLESWORTH B, LEVIN BR.Biological and biomedical implications of the co-evolution of pathogens and their hosts., 2002, 32(4): 569-577.

[30] WU W H, WANG L, ZHANG S, LIANG Y Q, ZHENG X L, YI K X, HE C P. Assessment of sensitivity and virulence fitness costs of thealleles fromto isoprothiolane., 2014, 13(4): 9701-9709.

[31] 汪文娟, 周繼勇, 汪聰穎, 蘇菁, 封金奇, 陳炳, 馮愛卿, 楊健源, 陳深, 朱小源. 八個抗稻瘟病基因在華南秈型雜交水稻中的分布. 中國水稻科學, 2017, 31(3): 299-306.WANG W J,ZHOU J Y,WANG C Y,SU J,FENG J Q,CHEN B,FENG A Q,YANG J Y,CHEN S,ZHU X Y.Distribution of eight rice blast resistance genes inhybrid rice in China., 2017, 31(3): 299-306. (in Chinese)

[32] IMAM J, ALAM S, MANDAL N P, SHUKLA P, SHARMA T R, VARIAR M. Molecular identification and virulence analysis ofgenes in rice blast pathogen,from Eastern India., 2015, 206(1): 21-31.

[33] TELEBANCO-YANORIA M J, IMBE T, KATO H, TSUNEMATSU H, EBRON L A, VERA CRUZ C M, KOBAYASHI N, FUKUTA Y. A set of standard differential blast isolates ((Hebert) Barr.) from the Philippines for rice (L.) resistance., 2008, 42(1): 23-34.

Analysis ofAvirulent Genes in the Infected Hybrid Rice Combinations Derived from a Sterile Line of Guang 8 A

WANG WenJuan, SU Jing, Yang JianYuan, WEI XiaoYan, CHEN KaiLing, Chen Zhen, Chen Shen, ZHU XiaoYuan

(Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640)

【Objective】The objective of this study is to analyze the avirulent genotypes ofderived from the hybrid rice combinations of Guang 8 A, and to provide a reference for rational distribution of cultivars with different blast resistant genes in South China. 【Method】A set of single-spore strain was subjected to pathotype analysis using blast monogenic differential lines. According to the functional markers of 8genes, which had been cloned and were associated with the rice blast pathogenicity, the haplotypes ofgenes were analyzed. The DNA, which extracted from the 27 strains of rice blast fungi, was used as a template for PCR amplification. The PCR products of avirulent full gene or CDS region were analyzed by agarose gel electrophoresis and sequencing, and their sequences were compared to corresponding avirulent genes.【Result】The tested strains showed high frequency (＞85%) of avirulence to the 5 monogenic differential lines, such as IRBLkh-K3 (), IRBLb-B (), IRBLz5-CA (), NIL-e1 () and IRBL9-W (), all strains were avirulent to IRBL9-W () and NIL-e1 (). These strains showed relatively low frequency of avirulence (＜20%) to the 7 monogenic differential lines, such as IRBLks-F5 (), IRBLa-A (), IRBL19-A () and so on, indicating that the strains from the combination of Guang 8 A showed different pathotypes to different rice blast-resistant lines.andfragments were almost present in all strains, and two haplotypes (-D and-E) ofwere identified. But none of,orwas amplified in any strain. The expected size products of,andcould be detected in some strains, but they all appeared in lower frequency and different mutation types in the tested strain. Amplicon sequencing of 7 strains (GD13-621, GD14-349, GD15-291,) revealed that the sequences of,andwere identical to those of the respective avirulent strains. This result indicated that these 3genes had a stable gene structure. Compared toin an avirulent strain,in the tested strains contained 2 nucleotide changes or 3 consecutive nucleotide insertions in the gene upstream region. The results indicated thathad a rich haplotype. The sequences ofin 6 strains were highly consistent, only contained one nucleotide changes in the coding region (136C/A), resulting in one amino acid substitutions (46H/N), which showed two haplotypes of(-D or-E).【Conclusion】In the strains from the major rice cultivars of Guang 8 A in South China, thedistributionofandwas relatively wide. In the susceptible areas of the above cultivars, the resistant cultivars carryingandcould be used as rotation planting cultivars.

hybrid rice combinations; Guang 8 A;; avirulent gene; rice blast-resistant lines

2018-06-22；

2018-08-09

國家重點研發計劃（2016YFD0300707）、廣東省現代農業產業技術體系（2017LM1075）、廣東省科技計劃項目（2015B020231003，2016B090918116，2016A020210026）、國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-01-32）

汪文娟，E-mail：juanlook@163.com。

朱小源，E-mail：zhuxy@gdppri.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.24.005

（責任編輯 岳梅）