長期施肥對棕壤叢枝菌根真菌群落結構及其侵染的影響

郭靜，羅培宇，楊勁峰，李冬冬，黃月玥，韓曉日

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長期施肥對棕壤叢枝菌根真菌群落結構及其侵染的影響

郭靜，羅培宇，楊勁峰，李冬冬，黃月玥，韓曉日

（沈陽農業大學土地與環境學院/土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室，沈陽 110866）

【目的】叢枝菌根(, AM)真菌有改善根際土壤環境、促進植物對養分的吸收、增強植物抗逆性和增加農作物產量等重要作用。本研究旨在探明長期施肥條件下玉米-大豆輪作棕壤叢枝菌根真菌群落結構、對玉米根系侵染的變化及其影響因素。【方法】以沈陽農業大學棕壤肥料長期定位試驗（38年）耕層（0—20 cm）土壤為材料，于2016年6月選取其中6個施肥處理：（1）不施肥處理（CK）；（2）單施化學氮肥（N）；（3）施用化學氮磷肥（NP）；（4）施用化學氮磷鉀肥（NPK）；（5）單施有機肥（M）；（6）有機肥和化學氮磷肥配施（MNP），采用PCR-DGGE、克隆測序及臺盼藍染色法，分析土壤和玉米根系定殖的AM真菌群落結構及侵染率，并結合環境因素進行冗余分析和典型對應分析。【結果】施用有機肥處理土壤的堿解氮（AHN）、速效磷（AP）、速效鉀（AK）、銨態氮（NH4+-N）、硝態氮（NO3--N）和可溶性有機碳（DOC）含量顯著高于單施化肥和不施肥處理，且趨勢為：有機肥處理>化肥處理>不施肥處理；與不施肥處理相比，單施化肥處理顯著降低了土壤pH值，而施用有機肥處理顯著提高了土壤pH值。通過PCR-DGGE及割膠測序，從土壤中得到AM真菌條帶22條，根系AM真菌條帶僅9條，共分離出13個OTU，從土壤樣品中分離的AM真菌種群主要為球囊霉菌和巨孢囊霉屬，而侵染玉米根系的AM真菌只有球囊霉菌。聚類分析表明長期不同施肥將棕壤中AM真菌分為了三大類群，分別為單施氮肥處理、施用有機肥處理和其他處理；根系AM真菌分為三大類群，第一類群NPK處理、第二類群為M處理和NP處理、第三類群為其他施肥處理。施用有機肥處理AM真菌的孢子密度顯著高于單施化肥和不施肥處理，趨勢為：有機肥處理﹥化肥處理﹥不施肥處理。各施肥處理AM真菌侵染率趨勢為：NPK處理>施用有機肥處理>其他施肥處理。冗余分析結果表明棕壤AM真菌多樣性與土壤理化性質無相關性，而孢子密度與土壤AHN、NH4+-N、AP、AK、DOC及土壤含水量呈顯著正相關；侵染率與土壤NO3--N呈顯著正相關；侵染率與孢子密度之間呈顯著正相關；AM真菌的多樣性與孢子密度和侵染率之間沒有相關性。典型對應分析表明AHN、AK、DOC、 NH4+-N 對AM真菌的群落組成影響顯著。【結論】長期施肥通過改變土壤理化性質，從而對棕壤AM真菌的群落結構產生了顯著影響，進而對AM真菌的侵染產生影響。

叢枝菌根真菌；棕壤；長期施肥；群落結構；侵染率

0 引言

【研究意義】叢枝菌根（，AM）真菌是一類與土壤肥力和植物營養關系密切的重要微生物，它可與絕大多數植物根系形成共生關系[1?2]，擴大宿主根系吸收范圍和吸收表面積、促進宿主作物對土壤中礦質元素和水分的吸收[3?6]、改善植物水分代謝、增強植物抗逆性、提高作物產量和改善土壤理化性狀[7]、對穩定生態系統、保持生態平衡和可持續發展，促進農、林、牧業生產具有不可替代的經濟、社會和生態意義。【前人研究進展】然而，由于AM真菌物種多樣性、對寄主作物的選擇性和對土壤環境的適應性不同[8]，利用AM 真菌促進植物在不同條件下定殖和生長需要考慮諸多因素的影響。有研究證實不同的土壤類型、植物類型、耕作制度、施肥措施等會對AM真菌多樣性、孢子密度、侵染有顯著的影響[9-13]；但目前對AM真菌影響因素的研究結果并不一致，有研究表明長期施有機肥對AM真菌的多樣性、侵染率和孢子密度有積極作用[14-15]，但JONER[16]研究發現施有機肥反而會抑制AM真菌的生長，而賈銳等[17]發現AM真菌的侵染率與土壤理化性質無相關性。MUCHANE等[18]研究發現在土壤中施入可溶性磷肥能增加AM真菌的定殖，而秀彥華等[12]發現AM真菌的侵染率與土壤磷含量呈極顯著負相關，以上現象可能是由于土壤類型、植物種類和施肥措施的不同引起的。【本研究切入點】鑒于AM真菌會受到多種因素的影響，而其對不同的土壤類型、農業措施的響應不盡相同。因此，探究不同條件對AM真菌的影響因素。【擬解決的關鍵問題】本研究在38年棕壤長期輪作施肥的基礎上，分析棕壤AM真菌群落結構、根系AM真菌侵染及其影響因素，探究作物、土壤理化性質和AM真菌之間的相互作用，以期為棕壤地區合理利用AM 真菌資源提依據。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

供試土壤與植物樣品采自沈陽農業大學棕壤肥料長期定位試驗地（北緯40°48′，東經123°33′），該試驗地始于1979年，到2016年已有38年歷史，采用玉米-玉米-大豆輪作制度，2016年種植玉米。該試驗地的基本概況見文獻[19]。本試驗選取其中6個施肥處理：（1）不施肥處理（CK）；（2）單施化學氮肥（N）；（3）施用化學氮磷肥（NP）；（4）施用化學氮磷鉀肥（NPK）；（5）單施有機肥（M）；（6）有機肥和化學氮磷肥配施（MNP）。所有肥料作為基肥在播前一次性施入，有機肥為豬廄肥，平均含有機質119.6 g·kg-1，全氮5.6 g·kg-1，P2O58.3 g·kg-1，K2O 10.9 g·kg-1；化學氮磷鉀肥分別為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀，肥料具體施用量見文獻[19]。

1.2 樣品采集及處理

土壤和植物樣品于2016年玉米苗期（6月6日）進行采集。各處理土壤采樣選取12個點，采樣深度為0—20 cm，每3個點充分混勻，剔除礫石、植物根系等雜物，過1 mm篩，一部分測定可溶性有機碳、銨態氮、硝態氮、土壤含水量及提取土壤總DNA；另一部分避光風干后保存，測定土壤pH、堿解氮、速效鉀、速效磷及孢子密度。挖取4株完整的玉米根系，用大量自來水沖洗干凈后再用滅菌的超純水沖洗，將洗凈的鮮根剪成1 cm長的根段，混勻提取DNA及測定侵染率。

1.3 測定方法

可溶性有機碳用K2SO4浸提法，即稱取10 g鮮土加入50 mL 0.5 mol·L-1K2SO4溶液振蕩1 h，然后在4 000×離心力下離心10 min，上清液用0.45 μm的濾膜過濾，濾液用Vario EL II 型TOC儀進行測定[20]。銨態氮和硝態氮的含量采用0.01 mol·L-1CaCl2浸提法，采用連續流動分析儀（AutoAnalyzer3，德國Seal公司）上機測定。pH、AP、AK、AHN、SM根據土壤農化分析所述方法測定[21]。AM真菌孢子密度采用濕篩傾析法，從20 g風干土壤中篩取孢子并進行孢子密度統計[22]，侵染率采用臺盼藍染色-格子線法測定[23]。

土壤DNA采用Powersoil?DNA isolation kit試劑盒（MO BIO, Laboratories Inc，German）進行提取，植物DNA采用DNeasy?Plant Mini Kit試劑盒（Qiage，German）進行提取，提取完的DNA置于-20℃冰箱待用。

1.4 目的片段的擴增及DGGE電泳

AM真菌的目的序列擴增采用巢式PCR[24]，第一輪反應體系為10×PCR Buffer（不含Mg2+）5 μL，dNTP 4 μL（2.5 mmol·L-1），MgCl23 μL（2.5 mmol·L-1），NS1（10 mmol·L-1）1.5 μL，NS41（10 mmol·L-1）1.5 μL，酶（2 U·μL-1）1 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O至50 μL。第二輪反應體系與一輪相同。為了提高DGGE的分辨率，在第二輪PCR上游引物前加了個GC夾（CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCGCC GCCCCCGCCCG）。由于AM1和NS31不能擴增原囊霉科（）和類球囊霉科（）的AM真菌，因此添加了另一對引物ARCH1311和NS8來擴增原囊霉科和類球囊霉科。本研究中DGGE電泳所用的聚丙烯酰胺凝膠的濃度為6%，變性劑范圍：30%—50%，電泳緩沖液：1×TAE，電泳電壓：60 V，電泳時間：16 h。PCR具體條件如表1所示。

1.5 DGGE割膠回收測序

從DGGE圖譜中切取清晰、具有代表性的條帶，采用聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒（北京康維）進行目的基因的回收。回收后的DNA用AM真菌的特異性引物NS31和AM1進行PCR擴增驗證，然后交由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行克隆測序。

表1 AM真菌目的序列PCR反應條件

1.6 數據分析及處理

圖表制作采用Microsoft Office Excel 2010；采用SPSS 19.00進行方差分析（最小顯著差數法，LSD）；冗余分析（Redundancy Analysis, RDA）及典型對應分析（Canonical Correlation Analysis, CCA）采用CANOCO 4.5軟件；DGGE圖譜分析采用Quantity one 4.6軟件；DNA序列比對在Gen Bank 數據庫的BLAST 程序中進行相似性搜索，查找與目的條帶親緣關系最近的序列，然后采用MEGA 6.0構建進化樹。多樣性指數采用Shannon-Wiener 指數（）和均勻度指數（）表示, Shannon指數（）計算公式為=-∑(ln)，均勻度指數（）計算公式為=/ln。式中，表示第條帶占所在泳道條帶總光密度值的比例，表示每一條泳道AM真菌的條帶數量。

2 結果

2.1 長期定位施肥對棕壤理化性質的影響

從表2可以看出，長期施肥顯著改變了棕壤的理化性質，施肥處理土壤的AP、AHN、NO3--N、NH4+-N、DOC、SM均比不施肥對照顯著增加，且趨勢為：有機肥處理﹥化肥處理﹥CK；與其他處理相比，MNP處理土壤AHN、NO3--N、NH4+-N、AP、AK、DOC含量最高。M處理的土壤pH最高，為6.64；N處理的pH最低，為4.87；與不施肥處理相比，施用有機肥顯著提高土壤pH，而化肥會使土壤pH降低，尤其是單施化學氮肥。

表2 供試土壤的理化性質

同一列數據后不同字母表示差異顯著（LSD法，=0.05）。下同

Values followed by different letters in the same column are significantly different among the treatments ( LSD method, and= 0.05). The same as below

2.2 長期施肥對AM真菌群落結構的影響

如圖1所示，NP處理的土壤AM真菌條帶數最多（9條），CK、N處理和M處理條帶數次之（7—8條），而NPK處理和MNP處理條帶數最少（6條），說明施用化學鉀肥及施用的含磷肥料不足或過多均會減少棕壤AM真菌的種類。band 16、band 17、band18、band 19和band 22是有機肥處理特有的條帶，說明施用有機肥促進了這幾種AM真菌的生長；band 20是所有施肥處理共有條帶，說明施肥沒有對此種AM真菌造成影響。

如圖2所示，NP、NPK、M處理的根系AM真菌的條帶數較多，而CK、N、MNP處理的條帶數最少；根系band 8是所有處理共有的條帶，沒有受施肥的影響；根系band 5是MNP處理特有條帶，說明有機肥與化學氮磷肥配施促進了該AM真菌的侵染。由圖1和圖2可以看出，從土壤中一共分離出來22條條帶，而根際中分離出來的條帶只有9條，說明只有部分AM 真菌能侵染玉米根系。

對土壤和根系AM真菌的DGGE圖譜中優勢條帶進行割膠回收，經克隆測序后共獲得31個序列，其中土壤AM真菌有22個序列，根系AM真菌有9個序列。通過GenBank數據庫的BLAST 程序進行序列比對，尋找與其親緣關系最為接近的物種構建進化樹，結果如圖3所示，sband 11、sband 15、sband 18、sband 19屬于巨孢囊霉科（Uncultured），而其余條帶均屬于球囊霉，根系AM真菌均屬于球囊霉，說明土壤中的AM真菌只有球囊霉侵染了玉米根系，而巨孢囊霉則未侵染玉米根系。

由表3可知，NP處理土壤中AM真菌的多樣性指數顯著高于其他處理，而NPK處理的多樣性指數最低，說明化學磷肥的施用有利于提高土壤AM真菌的多樣性，而化學鉀肥的施用則降低了土壤AM真菌的多樣性；另外MNP處理雖然未施入化學鉀肥，但其AM真菌多樣性指數與NPK處理無顯著差異，而顯著低于NP處理及M處理，這可能與MNP土壤磷水平過高有關。各處理間土壤AM真菌均勻度無顯著差異，說明不同施肥對土壤AM真菌的均勻度沒有影響。

圖1 不同施肥處理土壤AM真菌的DGGE圖譜

表3 不同施肥處理土壤AM真菌多樣性指數

由表4可知，NP、NPK和M處理根系AM真菌多樣性指數顯著高于其他處理，說明不施用化學磷肥或有機肥與化學磷肥配施均可降低侵染玉米根系的AM真菌多樣性；而CK、N處理根系AM真菌的均勻度均顯著低于其他處理，說明土壤缺磷對侵染玉米根系的均勻度有負面影響。

圖2 不同施肥處理根系AM真菌的DGGE圖譜

表4 不同施肥處理根系AM真菌多樣性指數

2.3 長期施肥對AM真菌孢子密度及侵染率的影響

由圖4可以看出，施用有機肥處理的孢子密度顯著高于單施化肥處理和不施肥處理，且趨勢為：有機肥處理＞化肥處理＞CK，其中MNP處理的孢子密度最多，為37.8個/g，而CK處理的孢子密度最少，為19.8個/g；施用化肥處理的孢子密度則介于它們兩者之間，為26.2—35.6個/g。這表明施肥有利于AM真菌孢子的產生，其中有機肥的施用對土壤AM真菌產孢具有積極影響。

sband 和pband 分別代表土壤AM真菌條帶和根系AM真菌條帶，后面不同的數字表示DGGE圖譜上所標條帶。Sband and pband represent the bands of soil AM fungi and infected AM fungi respectively. Different numbers behind symbols represent different bands marked in figures of DGGE

由圖5可以看出，施肥顯著增加了AM真菌的侵染。施肥處理的AM真菌侵染率顯著高于不施肥處理，其中NPK處理的侵染率最高，為25.77 %；NPK、M及MNP處理的侵染率顯著高于其他施肥處理，說明施用含鉀肥料能促進AM真菌對玉米根系的侵染，且化學鉀肥效果優于有機肥。

2.4 長期施肥對AM真菌群落結構的影響

如圖6所示，長期施肥將棕壤AM真菌分為三大類群，單施氮肥處理、施用有機肥處理和其他處理。其中，N處理和其他處理群落相似度僅為7%，說明長期單施化學氮肥極大地改變了棕壤AM真菌群落結構；施用有機肥處理與其他處理相似度為18%，說明長期施用有機肥對棕壤AM真菌群落結構也有較大影響；而CK處理與NPK、NP之間的相似度達到52%，說明化肥配施對土壤AM 真菌群落結構產生的影響較小。

由圖7可知，長期施肥將根系AM真菌分為三大類群。NPK處理和其他施肥處理之間的相似度為66%，單獨成為一個類群，說明施用化學鉀肥對AM真菌侵染產生了較大影響；M處理與NP處理分為一個類群，而MNP處理、N處理與CK處理分為一個類群，說明土壤速效磷含量過高或過低均會對AM真菌侵染產生影響。

圖4 不同施肥處理AM真菌的孢子密度

圖5 不同施肥處理AM真菌的侵染率

圖6 不同施肥處理土壤AM真菌 UPGMA聚類圖譜

圖7 不同施肥處理根系AM真菌 UPGMA聚類圖譜

2.5 AM真菌群落結構影響因素

冗余分析結果表明（圖8），長期定位施肥條件下，土壤及根系侵染的AM真菌多樣性指數與土壤理化性質無相關性，而其孢子密度與AHN、NH4+-N、AP、AK、DOC、SM呈顯著正相關，侵染率則與土壤中NO3--N呈顯著正相關。侵染率與土壤AM真菌的孢子密度之間由典型對應分析可知，土壤中AHN、AK、DOC和NH4+-N是影響棕壤AM真菌群落結構的主要因素（圖9），第一和第二排序軸解釋了63.7%的變量（＜0.05，通過蒙特卡羅檢驗）。其中band 5、band 10、band 16 、band 17、band 18、band 19和band 22所代表的AM真菌與土壤中AHN、AK、DOC和NH4+-N呈顯著正相關；而band 1、band 2、band 3 、band 4、band 11、band 12、band 13、band 15和band 21所代表的AM真菌與AHN、AK、DOC和NH4+-N呈顯著負相關，其余條帶所代表的AM真菌則與土壤理化性質無相關性。

3 討論

AM真菌作為自然生態系統的組成部分，能調節植物和土壤關系，在生態系統中有重要作用，因此，研究土壤及侵染的AM真菌群落結構及其影響因素具有現實意義。本研究中 AM真菌的DGGE圖譜中大多數條帶的遷移位置、數量和亮度在不同施肥處理間有差異，這說明長期不同施肥對棕壤AM真菌的生長產生了影響。其中施用化學鉀肥及施用含磷肥料不足或過多均會降低土壤AM真菌的多樣性，這與HARLEY等[25]的研究結果一致。值得注意的是，雖然NPK處理土壤AM真菌多樣性指數最低，但其根系侵染的AM真菌多樣性指數及侵染率均為最高，MNP、M處理次之，這可能是由于施用含鉀肥料能促進AM真菌在作物根系的侵染[26]，而施用化學鉀肥相對于施用有機肥更有利于AM真菌的侵染。 CK、N處理和MNP處理根系AM真菌多樣性指數均顯著低于其他施肥處理，這可能是由于土壤磷水平過高或過低均會影響侵染玉米根系的AM真菌多樣性。程俐陶等[27]研究發現AM真菌的侵染率在早春最低，隨后開始上升，在夏秋季達到頂峰，本研究中各施肥處理AM真菌的侵染率均較低（4.02%—25.77%），這可能由于AM真菌在玉米苗期侵染能力還不強，會隨著玉米生長逐漸升高，與程俐陶等研究結果類似。BHADALUNG等[28]對27年長期施肥處理的AM真菌多樣性進行了調查，發現長期施肥會降低AM真菌的多樣性，另一些研究表明AM真菌多樣性與土壤速效磷呈正相關關系[29]，而本研究中AM真菌多樣性與土壤理化性質無相關性，這種差異可能是由于AM真菌對施肥條件、宿主植物和環境條件的選擇性和適應能力不同，或進化過程中的歷史原因，造成AM真菌對土壤理化性質的敏感性不同[30]。王茜等研究表明地表球囊霉、光壁無梗囊霉、單孢球囊霉、根內球囊霉以及土著AM真菌均能夠成功侵染玉米根系[31]，說明AM真菌對宿主作物之間沒有明顯的專一性。本研究土壤中分離的AM真菌主要為球囊霉菌和巨孢囊霉菌，而玉米根系侵染的AM真菌只有球囊霉菌，這可能是由于特殊的施肥管理、土壤類型、環境條件造成侵染根系的AM真菌的優勢種群不同引起[32]。

圖8 AM真菌與土壤理化性質的冗余分析

核糖核酸型由三角形表示，根據核酸凝膠遷移位置來命名

本研究中孢子密度與土壤AHN、NH4+-N、AP、AK、DOC、土壤含水量呈顯著正相關，與鄧小軍等[33]研究結果一致，這可能是由于施肥提高了土壤中易利用態養分含量，從而有利于土壤微生物的生長[34]。AM真菌作為專性共生菌，其侵染率會隨著外界養分狀況的不同有所變化[35]，有研究發現一定范圍內AM真菌的侵染率與土壤中速效磷呈顯著正相關[36]。本研究中發現侵染率與土壤速效磷無相關性，這可能由于施用有機肥處理的土壤速效磷含量過高反而抑制了AM真菌的侵染，而侵染率僅與土壤中NO3--N呈顯著正相關，這可能是因為硝態氮含量越高，植物根系分泌作用就越旺盛[37]，而植物根系分泌物對AM真菌與植物形成共生體系起著重要的作用[38]。

肖艷萍等[39]發現土壤中AM真菌的多樣性和孢子密度之間有極顯著正相關關系，而本研究中AM真菌的多樣性與孢子密度間無相關性；也有研究表明侵染玉米能力強的AM真菌產孢能力弱，或者產孢能力強的AM真菌對玉米侵染性差[40]，而本研究中AM真菌侵染率與孢子密度之間呈顯著正相關，以上可能是由于土壤類型、植物種類和施肥措施的不同，導致AM真菌利用碳水化合物的能力不同，從而AM真菌在土壤中生長、侵染和產孢能力也會不同[41]。

CCA分析結果表明玉米苗期土壤中DOC、AHN和NH4+-N對AM真菌的分布有一定的影響，這可能是由于微生物的生長都離不開碳源和氮源，適宜的C/N 比能顯著影響微生物的群落結構[42]。AM真菌的群落分布也受到AK的影響，鉀肥的施用抑制了部分AM真菌的生長（表4和圖8），但是有研究表明土壤速效鉀對AM真菌的影響很可能不那么重要，而氮和磷對AM真菌的可能更重要[43- 44]，由于土壤速效鉀對AM真菌的影響研究也較少，因此其對AM真菌的影響有待進一步研究。

本研究使用DGGE技術來分析AM真菌的群落結構，但此技術存在自身的局限性。雖然本研究通過DGGE技術成功分離了AM真菌，但其與實際值之間可能還存在差距；另外，DGGE不能全面分析土壤中全部微生物群落，只能對微生物群落中數量大于1%的優勢種群進行分析[45]，本研究中6個處理土壤所獲得AM真菌條帶僅為22條，根系AM真菌條帶僅為9條，通過割膠測序僅獲得13個OUT。因此采用DGGE分析可能低估了土壤中及根系侵染的AM真菌多樣性。這些都可能是由于PCR引物特異性與覆蓋度不足造成[46]，因此在以后的研究中應對AM真菌的引物進行優化提高其特異性，或采用Illumina Miseq、第三代測序（Pac Bio）、生物標記物等方法來最大程度保證結果的準確性。

4 結論

長期定位施肥顯著改變了棕壤的理化性質，從而影響AM真菌的群落結構，進而對AM真菌的生長和侵染也產生影響。長期施肥條件下棕壤中AM真菌主要為球囊霉菌和巨孢囊霉菌，而侵染玉米根系的AM真菌只有球囊霉菌，堿解氮、速效鉀、可溶性有機碳和銨態氮是引起棕壤AM真菌種群變化的主要因素。長期施肥能促進棕壤AM真菌產孢及對玉米根系的侵染，土壤AM真菌孢子密度主要受到土壤堿解氮、銨態氮、速效磷、速效鉀、可溶性有機碳、土壤含水量的影響，而侵染率主要受到土壤硝態氮的影響。

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Influence of Long-term Fertilization on Community Structures and Colonization ofFungi in a Brown Soil

GUO Jing, LUO PeiYu, YANG JinFeng, LI DongDong, HUANG YueYue, HAN XiaoRi

(College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University/National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, Shenyang 110866)

【Objective】AM () fungi plays important roles like improving the rhizosphere soil environment, promoting the uptake of nutrients by plants, enhancing resistance of plant, and increasing crop yield and quality. This study aimed to explore changes of community structures and colonization rate of AM fungi and to find out the main factors which affected the changes under a corn-soybean rotation system and a long-term fertilization for 38 years in a brown soil. 【Method】Soil samples (0-20 cm) were taken from the six treatments of the long-term fertilization experiment in June 2016, including (1) no fertilizer (CK); (2) chemical N input (N); (3) chemical N and P input (NP); (4) chemical N, P and K input (NPK); (5) pig manure (M); (6) pig manure, chemical N and P (MNP). Then the soil samples were analyzed by using PCR-DGGE, gel-recovery, sequencing and trypan blue staining. Relationship between community and colonization rate of AM fungi and environmental factors were analyzed by Redundancy analysis and Canonical Correlation analysis. 【Result】The result showed that the contents of alkali-hydrolysable nitrogen (AHN), available phosphorus (AP), available potassium (AK) , ammonium nitrogen (NH4+-N), nitric nitrogen (NO3--N) and dissolved organic carbon (DOC) under organic fertilization treatments were significantly higher than them under the CK treatment and chemical fertilization treatments, and the trend was: organic fertilizer treatments > chemical fertilizer treatments > CK treatment. Compared with the CK treatment, soil pH was decreased in chemical fertilizer treatments and increased in organic fertilizer treatments. 22 bands of AM fungi from soil and 9 bands of AM fungi from root were obtained by gel-recovery, and 13 OTU were obtained by BLAST. The result of sequencing showed that AM fungi species isolated from soil samples were mainlyand, while infected AM fungi was onlyThe cluster analysis showed that community structures of soil AM fungi were divided into three groups under a long-term fertilization in a brownsoil, namely N treatment, organic fertilizer treatments and another fertilizer treatments. Community structures of infected AM fungi were also divided into three groups, namely NPK treatment, M treatment and NP treatment, and another fertilizer treatments. The spore density of AM fungi under organic fertilizer treatments was significantly higher than that under chemical fertilizer treatments and non-fertilizer treatment, and the trend was: organic fertilizer treatments > chemical fertilizer treatments > CK treatment. The trend of colonization rate of AM fungi under different fertilizer treatments was: NPK treatment > organic fertilizer treatments > another fertilizer treatments. Redundancy analysis showed that spore density was positively correlated with soil AHN, NH4+-N, AP, AK, DOC and soil moisture content, and colonization rate was positively correlated with nitric nitrogen content. The colonization rate was positively correlated with spore density, while diversity index of AM fungi was neither correlation with colonization rate nor with spore density. Canonical Correlation analysis showed AHN, AK, DOC and NH4+-N significantly influenced the ribotypes of AM fungi. 【Conclusion】The long-term fertilization changed community structures of AM fungi by changing the physicochemical properties of the soil, and then affected colonization of AM fungi.

fungi; brown soil; long-term fertilization; community structure; colonization rate

2018-04-16；

2018-07-10

國家自然科學基金（41501305）、國家重點研發計劃項目（2017YFD0200707）

郭靜，E-mail：m18302469630_2@163.com。

羅培宇，E-mail：ibtyoufe@163.com。通信作者韓曉日，E-mail：hanxiaori@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.24.008

（責任編輯 李云霞）