血漿miR-1266在心房顫動患者射頻消融術前后表達變化及其臨床意義

李 冰 劉牟林 王曉燕 李士軍

(大連醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧 大連 116011)

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一，隨著年齡增長房顫的發病率不斷增加,可以引起一系列臨床癥狀和嚴重并發癥，如心衰、血栓栓塞事件，甚至致殘、死亡等嚴重不良后果〔1〕。近年來，射頻消融術治療房顫已經得到廣泛應用，但是術后復發仍是目前房顫治療的最大困擾，始終沒有徹底有效的方法根治房顫〔2〕。只有通過對其發病機制的深入研究，才可以得出更有效和更安全的治療途徑。目前已證實多種與房顫相關的microRNAs參與了房顫發生機制的調控。microRNAs是一類非編碼的單鏈小RNA分子，能調控基因表達。有關研究表明循環microRNAs的水平變化與一些心臟疾病如：心力衰竭、心肌梗死、冠心病及心肌炎等關系密切〔3〕。但目前關于循環microRNAs在房顫中的相關調節作用的研究較少，探討循環microRNAs在房顫發生發展中的變化及臨床意義，將推動房顫發病機制的深入研究，為房顫診斷和治療帶來新的研究方向。本文觀察血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后表達變化及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1研究對象 挑選60例2015年3月至2016年1月在大連醫科大學附屬第一醫院入院并行射頻消融術的房顫患者，將其作為房顫組，其中陣發性、持續性和永久性房顫患者分別為26例、19例和15例，平均年齡為(64.55±6.34)歲，男34例，女26例。同期選擇在大連醫科大學附屬第一醫院體檢中心的健康體檢者20例作為對照組，平均年齡(63.78±5.35)歲，男11例，女9例。房顫組每例患者均有常規心電圖或24 h動態心電圖支持診斷。房顫組排除標準：年齡>80歲，甲狀腺功能亢進,糖尿病,血壓控制不良者,左心室功能減低〔左室射血分數(LVEF)<40%〕，嚴重冠狀動脈疾病,肝、腎功能障礙，急慢性感染性疾病，心肌結構性病變，伴有惡性腫瘤。服用β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體抑制劑或是他汀類的患者不影響入選。對照組年齡、性別與房顫組無明顯差異，無明顯循環系統、呼吸系統、消化系統、生殖泌尿系統疾病。本研究涉及的被測試者都已告知了研究目的，并簽署了知情同意書。

1.2標本彩集 房顫患者行射頻消融術前抽取外周靜脈血3 ml，對照組同期體檢抽取外周靜脈血3 ml，分別置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，4 h內分離血漿，1 500 r/min離心15 min，吸取上清液放于經高壓過的EP管中，并儲存在-80℃冰箱備用。房顫患者射頻消融術后1個月按術前同樣標準采血保存，術后復轉為竇性心律，期間無復發。

1.3主要試劑及儀器 miRNA酶血清血漿試劑盒(德國凱杰公司)，miR-1266引物和U6引物(Genepharma公司)，Rotor-Gene Q熒光定量PCR擴增儀(德國凱杰公司)，NanoDrop 2000微量核酸測定儀( 賽默飛世爾科技)。

1.4實驗方法 (1)提取RNA；(2)RNA反轉錄：反應條件：①25℃，30 min；②42℃，30 min；③85℃，5 min；④ 4℃保存。(3)實時熒光定量PCR。反應條件如下：預變性：95℃ 3 min；PCR反應，95℃，40個循環，12 s，62℃ 40 s，采集熒光信號。miR-1266的相對表達量用2-ΔCt表示，ΔCt=(目的microRNAsCt值-U6 Ct值)。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t、χ2檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1房顫組和對照組臨床資料和實驗室檢測指標比較 房顫組和對照組在性別、年齡、吸煙史、LVEF、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)方面差異無統計學意義(均P>0.05)，而在高血壓患者比例、左心房內徑(LAD)、收縮壓、舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酐(Cr)、B型腦鈉肽(BNP)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、D-二聚體水平方面兩組差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。在房顫亞組分析中，性別、吸煙史、高血壓患者比例、收縮壓、舒張壓、TC、TG、HDL-C、Cr方面組間差異無統計學意義(均P>0.05)，而年齡、LAD、LVEF、LDL-C、BNP、hs-CRP、D-二聚體水平方面組間差異有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

2.2血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后表達變化差異 血漿miR-1266在房顫組射頻消融術前后相對表達量分別為1.92±0.34和0.16±0.06，與對照組(相對表達量為1)比較，術前表達明顯上升而術后表達明顯下降，差異有統計學意義(均P<0.000 1)。

表1 房顫組和對照組臨床資料及實驗室檢測指標比較

表2 房顫亞組臨床資料及實驗室檢測指標比較

2.3血漿miR-1266在不同房顫類型患者射頻消融前術后表達差異 血漿miR-1266在陣發性房顫、持續性房顫和永久性房顫中相對表達量分別為1.65±0.25、1.91±0.37和2.42±0.96，同對照組(相對表達量為1)相比均明顯上升且不同類型房顫組之間比較差異均有統計學意義(均P<0.05)；而術后各組相對表達量分別為0.17±0.07、0.21±0.05和0.09±0.03，同術前相比均顯著下降，差異均有統計學意義(均P<0.000 1)。

3 討 論

在房顫亞組分析中，性別、吸煙史、高血壓患者比例、TC、TG、HDL-C、Cr方面組間差異沒有統計學意義，而左心房內徑、左室射血分數、LDL-C、Cr、BNP、hs-CRP、D-二聚體水平方面組間差異有統計學意義。房顫患者心房肌細胞容易發生結構上的改變，可導致高血壓、左房增大等；如果房顫持續發生，則心房肌細胞將產生不可逆的結構破壞，導致左室功能下降，如LVEF下降、實驗室檢測指標方面表現BNP增高等；同時發生并發癥可能性加大，尤其是血栓形成，D-二聚體有升高的趨勢〔4〕。

本研究顯示血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后的表達都存在變化，術前表達上調，術后同術前比較表達則明顯下降。研究顯示與房顫有密切聯系的靶基因有電壓門控鈉通道α亞基(SCN5A)、電壓門控鉀通道E家族β1亞基(KCNE1)、電壓門控鉀通道eag相關H家族2型(KCNH2)〔5〕，它們均是編碼離子通道的相關基因。心房電重構是房顫發生的重要病理生理改變之一，主要是通過縮短心房肌細胞的動作電位時程，從而使心肌細胞的有效不應期縮短，導致折返的發生。SCN5A是編碼Na通道α亞基的基因〔6〕，其功能缺失性突變可導致Na電流下降，房內傳導受到阻礙而變緩。功能獲得性突變同樣增加房顫發生的易感性，主要因為引起QT間期延長綜合征而導致房顫。造成以上表現的可能機制如下：①由于Na電流不斷增加，整個復極過程逐漸緩慢，此時L型鈣電流再激活導致早后除極；復極后Na電流繼續增加會進一步導致晚后除極。有關報道已表明了Na通道與房顫電重構密切相關，在Na電流大小同對照組比較顯著降低〔7〕。有研究發現，房顫患者右心耳組織快Na電流通道的表達降低，可使心肌細胞興奮性和電傳導速度均發生改變，維持房顫狀態〔8〕。可見SCN5A功能獲得性和缺失性的突變都與房顫有十分密切的聯系。由此推測，本文miR-1266術前增加，調控SCN5A表達下降，Na電流密度降低，術后則明顯逆轉。

KCNE1基因編碼的β亞單位與KCNQ1構成緩慢激活延遲整流鉀電流，即IKs電流〔9，10〕。IKs電流是心臟復極3相的重要離子流，與動作電位密切相關。因此，KCNE1表達變化或基因突變導致IKs電流發生改變，從而增加房顫易感性。Olesen等〔11〕研究指出KCNE1及其家族與房顫發生關系密切。由此推測，本文miR-1266術前增加，調控KCNE1表達變化或突變，IKS電流增加，導致動作電位(ADP)和有效不應期(AERP)縮短，房顫易感性增加，術后逆轉可能是和miR-1266明顯下降有關，ADP和AERP可能會相對延長。KCNH2定位于7號染色體上編碼心肌細胞快速激活延遲整流鉀通道(Ikr)的α亞基〔11〕。有研究證實，KCNH2編碼鉀通道Kv11.1,其獲得性和功能缺失性突變導致長、短QT綜合征，同房顫關系密切〔12〕。本文miR-1266調控KCNH2表達變化或突變，Ikr電流增加，導致ADP和AERP縮短，房顫易感性增加，術后逆轉可能是和miR-1266明顯下降有關，ADP和AERP可能會相對延長。

綜上，血漿miR-1266調控與心房電重構的病理生理改變十分相關，此外血漿miR-1266不同類型房顫之間術前和術后變化也有所差異。術前血漿miR-1266在陣發性房顫、持續性房顫和永久性房顫中表達均上調且增幅逐漸升高。其中在永久性房顫中上升最為顯著。術后表達同術前均明顯下降，其中永久性房顫患者術后血漿miR-1266表達下降最為顯著。可以預見，隨著房顫患者發作頻率和持續時間的增加，在不同房顫類型隨著電重構變化加大，血漿miR-1266的表達會有所升高，而術后1個月電重構逐漸消失，經過負反饋調節血漿miR-1266逐漸下降。總之，血漿miR-1266在房顫患者射頻消融術前后表達及其含量變化說明其與房顫發生發展關系十分密切，同時在不同房顫類型中血漿miR-1266表達和含量變化也存在差異。診斷時應綜合考慮患者的各方面情況，如聯合檢測多種細胞因子的水平、綜合考慮患者具體的臨床表現進行診斷和治療，因此可以將檢測血漿miR-1266、的表達情況和動態變化作為診斷的輔助指標。同時也可以作為一種疾病預后的指標，或是疾病嚴重程度的指標。此外，深入研究miR-1266靶基因，對房顫發病機制的調控，治療的分子靶點的研究有重大意義。