胃癌患者外周血Vδ2 T細胞表面Tim3表達

吳柳賡 楊林風 田 峰 矯亞男 崔換新 柳書云 孫 慧

(青島市海慈醫療集團內科，山東 青島 266000)

粗略估計胃癌每年可導致全球723 000人死亡〔1〕。據報道，約70%的胃癌患者來自發展國家〔2〕，其中絕大多數屬于腺癌，分為腸道型和彌漫型〔3〕。盡管新的臨床、生物和分子標志物的發現提高了胃癌的早期診斷率，但預后仍不理想〔4〕，會面臨復發和轉移的風險〔5〕。研究發現，胃癌患者的免疫系統處于免疫抑制狀態，可能與程序性死亡分子(PD-1)和T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(Tim)3等相關〔5～8〕。目前，已有文獻對胃癌患者外周血中CD4/8 T細胞表面Tim3分子表達及功能的研究〔9〕，但尚未有Tim3在胃癌患者Vδ2 T細胞表面的表達及功能的文獻報道。本文旨在探討胃癌患者外周血Vδ2 T細胞表面Tim3的表達情況及其對Vδ2 T細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2015年6月30日至2016年12月31日在青島市海慈醫療集團內科住院并行手術治療的胃癌患者30例，男21例，女9例，平均年齡(63.03±15.32)歲。納入標準：患者術前均未接受化療、放療或免疫治療；均經過組織病理學診斷為胃癌；知情同意。組織標本收集：收取患者癌組織標本，并同時收集20例患者癌旁組織標本作為對照，男11例，女9例，平均年齡(62.91±14.89)歲。組織標本離體后于10 min內分裝并凍存于液氮中保存，以備使用。

1.2外周血單個核細胞(PBMC)獲取方法 于清晨患者空腹狀態下抽取患者外周血10 ml，并用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋1倍。取1支50 ml離心管，先加入10 ml淋巴細胞分離液，隨后用吸管小心吸取稀釋血液樣本加于分離液面上(稀釋血液∶淋巴細胞分離液2∶1)，1 800 r/min離心20 min。離心后，離心管中由上至下分為4層(第1層為血漿層，第2層為環狀乳白色淋巴細胞層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細胞層)，用吸管吸取中間白色的淋巴細胞白膜層到另一15 ml離心管中，向離心管中加入10 ml PBS，混勻細胞后以1 000 r/min離心10 min，離心后吸棄PBS，并以10 ml PBS重懸細胞沉淀，再以600 r/min離心8 min，吸棄PBS，獲取的細胞沉淀即為PBMC用于后續實驗。

1.3Vδ2 T細胞比例及表面Tim3表達情況的測定方法 取1×106個上述獲取的PBMC于離心管中，加入1 ml含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌2次，每次以600 r/min離心8 min，并棄盡上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS重懸細胞加入相應的抗體(PE anti-CD3、FITC anti-Vδ2 TCR和APC anti-Tim3)，于4℃孵育30 min；孵育結束后，用1 ml含1% BSA的PBS洗滌2次，600 r/min離心8 min后吸棄上清，采用0.1 ml 1%多聚甲醛固定液重懸細胞待流式細胞儀檢測。

1.4腫瘤壞死因子(TNF)-α和穿孔素染色方法 預處理：以適量的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和離子霉素(Ion)于37℃預處理細胞6 h；染色：收取預處理后的細胞，用1 ml含1% BSA的PBS洗滌2次，按分子免疫組化染色法進行CD3和Vδ2的表面染色；染色結束后以透化液洗滌細胞2次，離心吸棄上清后加入APC抗-TNF-α和Pecy5抗穿孔素抗體，于室溫下避光孵育30 min后用透化液洗滌2次，棄盡上清，采用0.1 ml 1%多聚甲醛固定液重懸細胞待流式細胞儀檢測。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素分析。

2 結 果

2.1外周血Vδ2 T細胞比例比較 健康對照組外周血Vδ2 T細胞百分比〔(5.09±1.52)%〕明顯高于胃癌患者〔(0.94±0.48)%，P<0.01〕。

2.2Vδ2 T細胞表面Tim3表達情況比較 健康對照組外周血Vδ2 T細胞表面Tim3表達陽性率〔(1.94±0.96)%〕明顯低于胃癌患者〔(7.34±2.71)%，P<0.01〕。

2.3胃癌患者外周血Vδ2 T細胞比例及Tim3表達情況與胃癌臨床病理特征關系 胃癌患者外周血Vδ2 T細胞比例及表面Tim3表達與胃癌患者M分期及是否出現淋巴結轉移有關(P<0.05)，與T分期、年齡和性別差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌患者外周血Vδ2 T細胞比例及Tim3陽性表達與胃癌臨床病理特征關系

2.4Tim3對Vδ2 T細胞功能的影響 健康對照組Vδ2+TNF-α+細胞百分比為(31.78±7.94)%，Vδ2+穿孔素+細胞百分比為(18.94±4.93)%，激活Tim3信號通路后Vδ2+TNF-α+細胞百分比為(18.47±5.47)%，Vδ2+穿孔素+細胞百分比為(9.57±2.58)%，Tim3可顯著抑制Vδ2 T細胞TNF-α和穿孔素分泌能力(P<0.01)。

3 討 論

Tim家族成員主要包括Tim1、Tim3和Tim4〔10，11〕，而Tim3是新近發現的Tim家族的一員〔12～14〕。研究發現〔15～17〕，Tim3在機體多種腫瘤組織中均有表達，且與腫瘤患者的預后及體內T細胞耗竭密切相關。有研究表明，多種腫瘤組織浸潤的CD4/8 T細胞表面Tim3的表達水平均出現顯著升高〔9，18〕。

T細胞根據T細胞受體(TCR)表達的不同主要分為αβT細胞和Vδ T細胞兩個細胞亞群〔19〕。Vδ T細胞只占CD3細胞的1%～10%〔20〕，Vδ T細胞可進一步分為兩個細胞亞群：主要分布于上皮性相關的淋巴組織中的Vδ1 T細胞和主要分布于外周血Vδ2 T細胞〔21，22〕。Vδ2 T細胞主要參與炎癥反應，具有腫瘤殺傷功能，而Vδ1 T細胞主要具有免疫調節功能〔23〕。本研究結果提示，Tim3可能通過參與胃癌發生發展過程中Vδ2 T細胞功能的耗竭，促進了胃癌的發生和發展，而且Tim3可顯著抑制Vδ2 T細胞的細胞因子分泌能力和殺傷功能。胃癌患者外周血Vδ2 T細胞比例的降低及其表面Tim3表達水平的升高可能與胃癌進展密切相關。