利拉魯肽對胰島素抵抗大鼠肝臟GRP78-JNK-GLUT2通路的影響

郭曉宇 高 宇 宋 娜 山秀杰 葛曉春 馮增斌 劉曉燕

(承德醫學院附屬醫院內分泌科，河北 承德 067000)

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)及代謝綜合征發病共同病理生理基礎，肝臟是胰島素作用主要靶器官之一，更是胰島素調節機體糖、脂代謝的重要效應器官。胰高血糖素樣肽(GLP)-1類似物利拉魯肽是目前治療T2DM的新型降糖藥物，最新研究發現利拉魯肽還可顯著減輕T2DM大鼠肝臟IR〔1〕。持續的內質網應激(ERS)發生在胰島素作用的主要靶組織(肝臟、脂肪、肌肉等)可引起IR，但具體機制不明〔2〕。本實驗通過觀察高脂喂養大鼠肝臟ERS相關分子葡萄糖調節蛋白(GRP)78、c-jun氨基末端激酶(JNK)及胰島素受體相關因子蛋白激酶B(AKT)、葡萄糖轉運子(GLUT)2表達的影響，探討不同濃度利拉魯肽利拉魯肽對肝臟ERS及IR的干預效應。

1 材料與方法

1.1實驗材料 游離脂肪酸測定盒及三酰甘油(TG)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。TRIzol 購自美國Invitrogen公司，引物合成于Invitrogen上海貿易有限公司，cDNA反轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購自天根生化科技有限公司，AKT抗體購自SANTA CRUZ公司，其余抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。利拉魯肽購自丹麥諾和諾德公司。

1.2實驗動物 4月齡健康Wistar雄性大鼠54只，體重250 g左右，購自北京維通利〔合格證號：SCXK(京)2012-0001〕，實驗期間室內溫度(22±2)℃，相對濕度(50±5)%，每 12 h光照/黑暗循環 (光照時間7∶00～19∶00)，自由飲水、進食。

1.3方法

1.3.1動物分組及模型制備 大鼠適應性喂養3 d后，隨機分為對照(NC)組16只與高脂喂養組38只，普通飼料及高脂飼料購自北京科奧協力有限公司。普通飼料熱量組成：碳水化合物64.19%，脂肪12.04%，蛋白質23.77%，總熱量為337 kCal/100 g。高脂飼料熱量組成：碳水化合物30.01%，脂肪53.75%，蛋白質16.24%，總熱量為486 kCal/100 g。喂養8 w末行清醒狀態下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗〔2〕，計算葡萄糖輸注率(GIR)，確定高脂喂養大鼠IR狀態是否造模成功。

1.3.2給藥方案 成膜后將高脂飼養組隨機分為高脂組(HFD組，高脂飲食+生理鹽水皮下注射)；利拉魯肽低劑量組(LL組，高脂飲食+100 μg·kg-1·d-1利拉魯肽皮下注射)；利拉魯肽高劑量組(HL組，高脂飲食+200 μg·kg-1·d-1利拉魯肽皮下注射)；NC組給予0.5 ml生理鹽水皮下注射。藥物干預2 w后，各組取5只大鼠再行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗。

1.3.3血清生化指標檢測及肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色 采用全自動生化儀測定TG、丙氨酸轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉移酶(AST)。取肝組織，行HE染色觀察其病理學改變。

1.3.4血清游離脂肪酸(FFA)及肝臟內TG(LTG)檢測 按照相應酶聯免疫吸附法(ELASIA)試劑盒說明書方法(購自南京建成生物工程研究所)。

1.3.5口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)實驗 藥物干預2 w后，4組大鼠隨機各取5只進行實驗。取尾部一滴血，測空腹血糖。大鼠灌糖后，測30、60、120 min血糖。計算大鼠葡萄糖曲線下面積(AUC)，公式為AUC= (0′+30′)/4+(30′+60′)/4+(60′+120′)/2。

1.3.6Western印跡檢測肝臟組織相關蛋白表達量 取適量肝組織液氮下研磨成粉末，加入組織裂解液，冰上勻漿后4℃ 14 000 r/min離心30 min，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。配備12%分離膠和4%濃縮膠。轉膜后用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，分別加入一抗兔抗鼠GRP78、JNK、JNK磷酸化(P-JNK)、AKT、AKT磷酸化(P-AKT)、GLUT2，按4℃孵育過夜，次日室溫用辣根過氧化物酶標記二抗羊抗兔孵育2 h，TBST洗膜后進行曝光顯影。利用圖像分析軟件Image J對顯影條帶進行灰度值進行定量分析。用“目的蛋白灰度值/內參灰度值”代表目的蛋白的相對表達量情況。

1.3.7總RNA提取和熒光定量PCR檢測肝臟相關基因的表達 應用Trizol試劑提取各組大鼠肝臟總 RNA。以β-actin作為內參。每個循環 94℃，變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸 15 s。利用檢測到的熒光信號，得到每份標本的擴增曲線及熔點曲線，檢測反應的特異性，得到各自的Ct值，每組均重復3次。GRP78引物序列：上游引物5′-AACCCAGATGAGGCTGTAGCA-3′，下游引物5′-ACATCAAGCAGAACCAGGTCAC-3′，產物長度約158 bp。GLUT-2引物序列：上游產物5′-GGCCTCTGTGGAAAATGTCTC-3′，下游產物5′-AGGGTACATGGTGGTGCC GCCGAGA-3′，產物長度約176 bp。β-actin引物序列：上游產物5′-TGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游產物5′-TGCTAGGAGCCAGGGCAGTAA-3′，產物長度約138 bp。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行LSD-t檢驗、方差分析及直線相關分析。

2 結 果

2.1一般項目結果 與NC組相比，HFD、LL、HL組的體重、血FFA(除HL組)、TG、LTG、AST、ALT均顯著升高(P<0.05)；與HFD組相比，HL組的體重、血FFA、TG、LTG、AST、ALT均明顯下降(P<0.05)。與HFD組相比，LL組僅FFA、AST、ALT明顯下降(P<0.05)。與LL組相比，HL組體重、FFA、LTG、TG、AST、ALT均明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 四組大鼠一般資料的比較

與NC組相比：1)P<0.05；與HFD組相比：2)P<0.05；與LL組相比：3)P<0.05，下表同

2.2光鏡觀察大鼠肝細胞形態學變化 NC組肝組織結構完整、清晰，肝小葉結構正常，中央靜脈大而壁薄，肝細胞索在中央靜脈周圍呈放射狀分布，HFD組肝細胞體積明顯增大，胞質內可見大小不一的脂滴空泡，胞核被推向周邊，LL組肝細胞體積有所減小，胞質內脂滴空泡明顯減少，HL組肝小葉和肝竇結構清晰，細胞排列整齊，細胞僅可見少許脂滴空泡。見圖1。

2.3OGTT結果 與NC組比較，HFD組大鼠各時間點血糖均明顯升高、AUC明顯增加(P<0.05)；與HFD組比較，HL組各點血糖和AUC均明顯下降(P<0.05)，LL組各時間點血糖與AUC下降，但僅120 min血糖差異有統計學意義(P<0.05)；與LL組比較，HL組0 min、120 min血糖和AUC明顯下降(P<0.05)，見表2。

圖1 各組大鼠肝臟形態學變化情況(HE，×200)

組別血糖(mmol/L)0 min30 min60 min120 minAUCNC組5.26±0.316.14±0.817.48±1.005.51±0.2813.44±1.06HFD組7.04±0.511)10.38±1.681)10.84±1.201)7.84±0.341)18.95±1.391)LL組6.36±0.369.14±0.748.84±0.826.63±0.802)16.21±0.65HL組5.73±0.762)3)8.91±0.872)8.66±0.752)6.23±0.682)3)14.77±0.552)3)

2.4Western印跡法檢測大鼠肝臟相關蛋白表達情況 與NC組相比，HFD組GRP78、P-JNK/JNK蛋白表達顯著升高，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表達顯著減少(P<0.05)。與HFD組相比，HL組、LL組 GRP78、P-JNK/JNK蛋白表達均下降(P<0.05)，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表達均增加(P<0.05)。與LL組相比，HL組GRP78、p-JNK/JNK蛋白表達下降(P<0.05)，GLUT2、P-AKT/AKT蛋白表達增加(P<0.05)。如圖2、圖3，表3。

圖2 GRP78、GLUT2蛋白表達情況

圖3 JNK、AKT磷酸化情況

組別GRP78GLUT2P-JNK/JNKP-AKT/AKTNC組0.54±0.021.03±0.020.86±0.081.69±0.01HFD組1.24±0.081)0.21±0.011)1.67±0.071)1.08±0.021)LL組0.97±0.031)2)0.54±0.021)2)1.15±0.071)2)1.35±0.011)2)HL組0.62±0.051)2)3)0.82±0.021)2)3)0.96±0.011)2)3)1.55±0.021)2)3)

2.5Real-Time RCR 法檢測大鼠肝臟GRP78、GLUT2 mRNA表達情況 與NC組大鼠相比，HFD組大鼠的GRP78 mRNA的表達顯著增高，GLUT2 mRNA表達顯著減低(P<0.05)；與HFD組大鼠相比，LL組及HL組大鼠GRP78 mRNA的表達均顯著降低(P<0.05)，與LL組大鼠相比，HL組減低更為明顯(P<0.05)；與HFD組大鼠相比，LL組及HL組GLUT2 mRNA的表達均顯著上調(P<0.05)，但HL組上調程度顯著高于LL組(P<0.05)。見表4。

2.6單因素相關分析 GIR與體重、FFA、LTG、TG呈負相關(P<0.05,P<0.01)。GRP78蛋白表達量與FFA、LTG、TG呈正相關，與GIR呈負相關(P<0.05,P<0.01)。GLUT2蛋白表達量與FFA、LTG、TG呈負相關，與GIR呈正相關(P<0.01)，見表5。

表4 4組大鼠肝臟GRP78、GLUT2 mRNA表達情況

表5 大鼠GIR及肝臟GRP78、P-JNK、P-AKT、GLUT2蛋白相關分析

3 討 論

ERS與肥胖、IR和T2DM等的發病環節密切相關〔3〕。GRP78是ERS反應標志性分子伴侶，蛋白激酶樣內質網激酶(PEPK)，轉錄激活因子(ATF)6，和肌醇激酶(IRE)1α與GRP78在內質網膜上相結合，以保持其非活動狀態，當錯誤折疊的蛋白質在ER腔中積聚時，分子伴侶GRP78與以上三個受體解離，以促進未折疊或錯誤折疊的蛋白進行正確折疊。本研究證實高脂喂養大鼠肝臟發生了ERS，伴有GIR下降，出現IR，與既往研究結果肝臟發生ERS時促進機體IR的加劇相符合〔4〕。ERS激活IRE-1α，繼而引起JNK信號通路活化〔5〕，活化后JNK使胰島素刺激的P-AKT和胰島素受體底物(IRS)-1酪氨酸磷酸化受到抑制阻止了胰島素信號的傳導，降低了胰島素在外周組織的敏感性，導致IR的發生〔6，7〕。利拉魯肽是目前研發的GLP-1類似物，不僅可以改善胰島B細胞功能促進胰島素分泌發揮降糖作用，還可顯著減輕T2DM大鼠IR〔8〕。本研究說明利拉魯肽有改善IR發揮降糖作用，與既往Díaz-Soto等〔9〕研究一致。本實驗提示IR減輕與ERS緩解相關。利拉魯肽呈濃度依賴性改善大鼠ERS，減輕IR。有研究發現，GLP-1類似物可刺激糖尿病大鼠肝臟、肌肉及脂肪組織GLUT2、GLUT4蛋白及mRNA的表達，從而增加機體對胰島素的敏感性〔10〕。利拉魯肽是否通過降低FFA和肝內脂質沉積，影響內質網GRP78-JNK-AKT-GLUT2通路，改善ERS，減輕肝臟IR，目前尚未報道。綜上，高脂飲食可導致FFA及肝內脂質蓄積，發生ERS，導致IR，利拉魯肽可呈依賴性緩解高脂喂養大鼠肝臟內質網應激，減輕IR，其機制可能與利拉魯肽使肝細胞內質網應激分子伴侶GRP78蛋白表達水平下降及JNK-AKT-GLUT2通路有關，然而其具體的分子機制還待進一步研究。