香訶止瀉顆粒劑揮發油提取和包合工藝研究

柯瑾 梁玲 周田婷 朱培芳 喬宏亮 熊磊

摘要：目的建立廣藿香揮發油提取和包合工藝條件。方法采用L9（3）4正交設計法對揮發油的提取和包合工藝進行考察。結果香訶止瀉顆粒劑廣藿香揮發油提取工藝優化為：浸泡4 h，加10倍水，回流提取8 h;揮發油β-環糊精包合工藝優化為：揮發油按1∶20（V/V）比例用乙醇溶解，揮發油與β-環糊精包合的比例為1∶8，揮發油醇溶液緩慢加入8%的β-CD溶液，55 ℃超聲包合2 h。結論優化的提取和包合工藝合理、可行、穩定可控，可為申報醫療機構制劑奠定基礎。

關鍵詞：香訶止瀉顆粒劑;廣藿香酮;β-環糊精包合（β-CD）

中圖分類號：R2842? ? 文獻標志碼：B? ? 文章編號：1007-2349（2018）06-0068-05

Study on Extraction and Inclusion Process of Volatile Oil from Xianghe Anti-diarrhea Granules

KE Jin1，Liang Ling1，ZHOU Tian-ting2，ZHU Pei-fang1，QIAO Hong-liang3，XIONG Lei1

（1 .Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China;

2 .Puer Songsao Grass Six Flavors Pharmaceutical Co ，Ltd ，Puer 665000，China;

3. Jilin Zixin Hannya Pharmaceutical Co ，Ltd ，Qingshi132300，China）

【Abstract】Objective：To establish the extraction and inclusion conditions for the volatile oil of patchouli Methods：L9（3）4 orthogonal design method was used to investigate the extraction and inclusion of volatile oil Results：The optimal extraction process of the volatile oil of patchouli from Xianghe anti-diarrhea granules was as follows：soak for 4 h，add 10 times water and reflux for 8 h The optimal inclusion process of the volatile oil of β-cyclodextrin was as follows：volatile oil at 1：20（V/V）dissolved by ethanol，the 1：8 of ratio of volatile oil to β-cyclodextrin，followed by slowly adding 8% of β-cyclodextrin solution for 2 hours of inclusion at 55°C ultrasound condition Conclusion：The optimal extraction and inclusion process is reasonable，feasible，stable and controllable，and can lay the foundation for applying pharmaceutical agents

【Key words】Xianghe anti-diarrhea granules，patchosterone，β-cyclodextrin inclusion（β-CD）

香訶止瀉顆粒劑源于云南省名中醫熊磊治療小兒泄瀉的臨床效驗方，臨床療效確切。本方具芳香化濕、運脾止瀉之功，主治小兒脾氣不運、濕濁內阻之泄瀉[1]。由云南主產藥材藿香、葛根、訶子、石榴皮等9味中藥組成。中醫認為，泄瀉病變主要在脾胃，尤其與脾的運化功能失調關系密切[2]。脾主升清，胃主降濁，若脾胃失常，清氣不升，濁氣不降，清濁相并，下走大腸則至泄瀉。前人亦有“無濕不成瀉”、“濕多成五瀉”之說，故治療上總以運脾化濕為基本原則[3]。

香訶止瀉湯中廣藿香味辛、性微溫、入脾胃經，具有芳香化濁，化濕止嘔之功[4];訶子性平、味酸澀，酸能收斂，澀能止瀉[5]，與廣藿香共為君藥，兩藥相配，共湊健脾化濕、溫胃化濁、澀腸止瀉之功，且有標本兼治之妙。葛根味辛甘、性涼，入脾胃經，具有生津止渴，升陽止瀉之功[6]，茯苓健脾利水滲濕[7]，車前子滲濕止瀉，能“利小便實大便”[8]，三藥共為臣藥。其余藥物能行氣、化濕、消痞，分別針對嘔吐、痞脹、疼痛等泄瀉伴隨癥狀起輔助治療作用。諸藥合用，共湊健脾除濕、運脾化濁、行氣止痛、溫中固澀之效，使濕去脾運則腹瀉自愈。

劑型選擇為療效確切、服用方便、便于攜帶、成本低、口感好、兒童順應性好的顆粒劑，既保持了傳統的中醫藥用藥特色，又能最大限度地提取并保留處方中藥揮發油不在煎煮過程中的揮散，本研究對方中君藥廣藿香揮發油的提取和包合進行研究。

1 儀器與試藥

1.1.儀器Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;C18色譜柱（ZOR BAX SAX-C18 46×250 mm，5 μm）;萬分之一分析天平（上海菁海儀器有限公司）;電子秤（余姚市金諾天平儀器有限公司）;超聲波清洗機（YL-040S型，上海冠特超聲儀器有限公司）;電子調溫電熱套（PHTW型，鞏義市器華儀器有限責任公司）;多頭磁力加熱攪拌器（HJ-4B型，常州國華電器有限公司），電熱恒溫干燥箱（DHG-9071A型，上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2.藥材與試劑廣藿香選用《中國藥典》（2015版一部）收載的正品（批號：150201），購自云南泰華豐功藥業有限公司。β-CD（純度≥990%，上海瑞永生物科技有限公司）;廣藿香酮（純度>98%，批號為151014，成都普菲德生物技術有限公司）。乙腈（色譜純，默克股份兩合公司;磷酸、乙醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠）;純凈水（娃哈哈公司）。

1.3.試驗方法

1.3.1.廣藿香酮含量測定方法研究[10]

1.3.1.1.色譜條件色譜柱：C18色譜柱（ZOR BAX SAX-C18，46×250 mm，5 μm）流動相：乙腈-02%磷酸溶液（60∶40，V/V），等度洗脫15 min;檢測波長：310 nm;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃。

1.3.1.2.對照品溶液的制備取廣藿香酮適量，加乙醇制成1 mL含22 μg的溶液，045 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.3.1.3.供試品溶液的制備取廣藿香油適量，加乙醇制成1 mL含500 μg的供試品溶液，045 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.3.1..4線性關系考察精密吸取對照品溶液1，2，4，8，12，16，20 μL，測定峰面積，以峰面積（Y）對進樣量μg（X）進行線性回歸。

1.3.1.5.精密度考察精密吸取對照品溶液10 μL，連續測定6次，記錄峰面積。

1.3.1.6.重現性考察取適量廣藿香油，按供試品溶液制備方法平行操作6份，測定廣藿香酮峰面積，計算廣藿香酮含量。

1.3.1.7.穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液，于0，2，4，8，12 h分別進樣，測定并記錄峰面積。

1.3.1.8.加樣回收率試驗同一批廣藿香油（含量：365%）取6份，每份005 g，精密稱定。分別精密加入一定量的廣藿香酮對照品溶液（約為樣品中廣藿香酮含量的10倍量），按供試品溶液制備方法制備樣品，分別測定廣藿香酮峰面積，計算回收率。

1.3.1.9.耐用性考察改變柱溫、流速、波長、流動相比例，考察峰面積的差異。

樣品的測定 取3份樣品，每份01 g，按供試品溶液制備方法制備樣品，測定樣品中廣藿香酮的含量。

1.3.2.揮發油提取工藝研究[11]

1.3.2.1.揮發油提取率考察廣藿香750 g，8倍量水，浸泡8 h，從出第一滴蒸餾水開始計時，記錄不同時間點揮發油體積并計算提取率（揮發油提取率（%）=揮發油收得量（ mL）/藥材重量（g）×100）。

1.3.2.2.提取工藝正交考察經預試驗，以廣藿香油中廣藿香酮的含量和揮發油提取率為綜合評分指標，進行L9（34）正交實驗，篩選藥材浸泡時間，加水量以及提取時間條件，以確定最佳提取條件，因素水平見表1。（綜合評分=廣藿香酮的含量/0289×30%+揮發油得率/001×70%）

1.3.2.3.驗證試驗取同一批廣藿香3份，每份200 g，加10倍水，浸泡4 h，提取8 h，測定揮發油提取率和廣藿香酮含量。

1.3.3.揮發油包合工藝研究[12]

1.3.3.1.包合物中揮發油的測定將已稱定重量的包合物置于圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，連接揮發油提取器。按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則目次2204揮發油測定法項下操作，讀取揮發油體積，計算包合物的揮發油包封率（包封率（%）=包合物中揮發油回收量（ mL）/（揮發油加入量（ mL）×空白回收率）×100）。

1.3.3.2.揮發油空白回收率的測定量取揮發油10 mL，置于圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，按“222”方法蒸餾，記錄揮發油體積，計算空白回收率（空白回收率（%）=揮發油回收量（ mL）/量取揮發油量（ mL）×100）。

1.3.3.3.包合方法的篩選取2份β-CD制成8%的飽和水溶液，將1 mL廣藿香揮發油用20 mL乙醇溶解，恒溫50℃下分別在電動攪拌、超聲狀態下將揮發油乙醇溶液慢慢滴入β-CD飽和水溶液中，包合2 h。待包合溶液冷卻至室溫后，放入冰箱冷藏過夜，抽濾，包合物用少量乙醇多次洗滌，置恒溫烘箱中（40℃）下干燥24 h，稱重，計算包合物得率和包封率

1.3.3.4.乙醇濃度的考察取1 mL廣藿香揮發油3份，分別用無水乙醇、乙醇、90%乙醇20 mL溶解，恒溫50℃下加入8%β-CD飽和溶液，超聲法包合2 h，計算得率和包封率。

1.3.3.5.乙醇用量的考察將1 mL廣藿香揮發油分別用10 mL、15 mL、20 mL乙醇溶解，照“1334”制備包合物，計算得率和包封率。

1.3.3.6.廣藿香揮發油包合的正交試驗經初步試驗，以揮發油包封率為指標，進行L9（34）正交試驗，篩選揮發油與β-CD的比例、β-CD的濃度、包合溫度、包合時間條件，以確定最佳包合條件，因素水平表見表2

1.3.3.7.驗證試驗稱取3份β-CD于錐形瓶中，照“1336”篩選最佳條件進行包合，測定揮發油回收量，計算得率和包封率。

2 結果與分析

2.1.廣藿香揮發油提取工藝研究

2.1.1.廣藿香酮含量測定方法研究

2.1.1.1.線性關系考察線性回歸方程為：Y=68838X-45596，r =1。表明廣藿香酮進樣量在00224～0448 μg時，其與峰面積呈良好的線性關系，結果見圖3。

2.1.1.2.精密度考察6次測定廣藿香酮峰面積RSD為018%，表明儀器精密度良好。

2.1.1.3.重復性考察廣藿香酮含量計算RSD為115%，廣藿香酮平均含量為365%，表面該方法重現性良好。

2.1.1.4.穩定性考察 以廣藿香酮的峰面積計算RSD為033%，表明供試品溶液0～12 h內穩定。

2.1.1.5.加樣回收率考察平均回收率為9724%，RSD為175%。

2.1.1.6.耐受性考察該方法耐受性良好，結果見表3：

因為檢測器屬于濃度型檢測器，當樣品量一定時，檢測器瞬間響應，峰高響應值與流動相流速無關，峰面積響應值與流動相流速成反比，峰面積與流速乘積為常數;且08×8378≈12×5592，所以，該方法耐用性好。

2.1.1.7.樣品測定三批樣品廣藿香酮含量分別為364%、365%和365%，說明該方法穩定可控。

2.2.揮發油提取工藝研究

2.2.1.廣藿香揮發油提取率考察由表4和圖4可知藿香揮發油在提取8h以后就不再出油，所以在提取工藝研究中設8 h為最長的提取時間。

2.2.2.揮發油提取工藝正交試驗結果由表5可知B>C>A，由此可見提取時間對揮發油得率和藿香油的廣藿香酮含量影響較大;初步確定最佳提取條件為A1B3C2，即浸泡時間為4 h，提取時間為8 h，加水量為10倍量。

2.2.3.驗證試驗三批樣品揮發油得率分別為08%、08%、08%，廣藿香酮含量分別為258%、256%、258%，說明此提取條件穩定可行。

2.3.揮發油包合工藝研究

2.3.1.揮發油空白回收率考察本實驗空白回收率為90%。

2.3.2.包合方法考察超聲法的包合效果比電動攪拌法稍好，所以采用超聲法包合結果見表6。

2.3.4.乙醇濃度考察用乙醇溶解揮發油制備包合物的包封率高于用90%乙醇和無水乙醇，因此，選擇乙醇作廣藿香揮發油溶劑，結果見表7。

2.3.5.乙醇用量考察將1 mL揮發油用20 mL乙醇溶解包合效果最佳，因此確定為包合條件，結果見表8。

2.3.6.正交試驗結果由表9可知，A>B>C>D，因此得出結論：各因素對包合物揮發油包封率的影響大小為：揮發油與β-CD比例>β-CD濃度>包合溫度>包合時間。確定最佳包合條件為A3B1C3D3，即最佳包合條件為揮發油：β-CD為1：8，β-CD濃度為8%，55℃包合2h。

2.3.7.驗證試驗該包合條件較穩定，結果見表10。

3 結論

本試驗研究建立了香訶止瀉顆粒劑揮發油提取及包合工藝。通過正交試驗篩選，確定香訶止瀉顆粒劑廣藿香揮發油提取工藝為：浸泡4 h，加10倍水，回流提取8 h;揮發油β-環糊精包合工藝為：揮發油按1：20（V/V）比例用乙醇溶解，揮發油與β-環糊精包合的比例為1∶8，揮發油醇溶液緩慢加入8%的β-CD溶液，55 ℃超聲包合2 h。本工藝條件合理穩定可控，為制劑研發醫療機構制劑奠定基礎。

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