腸源性內毒素血癥對慢性乙型肝炎患者細胞免疫功能影響

莊潔偉，郭輝，郭文麗，汪小娟

（廣東省深圳市寶安區人民醫院 檢驗科，廣州 深圳 518100）

慢性乙型肝炎是指乙肝病毒檢測為陽性，發病日期不確定或病程在半年以上且臨床有慢性肝炎表現者，以肝區疼痛、腹脹及惡心等為主要臨床表現，隨著病情加重，患者可出現肝功能異常、脾大及肝病面容等，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。我國是世界上病毒性肝炎的高發地區，據統計，目前乙肝病毒攜帶者高達1.3億，給社會經濟造成沉重的負擔，已經成為一個急需解決的重要問題[3]。目前，臨床上關于慢性乙型肝炎的治療尚無有效的治療方法，核苷類似物和干擾素是臨床上廣泛使用的藥物，但效果并不理想，副作用較大[4-5]。為找出肝病的有效治療手段，需要進一步探索肝炎的發病機制。近年來，內毒素及細胞因子形成的免疫網絡在乙型肝炎發病中的作用日益受到重視，本研究探討腸源性內毒素血癥對慢性乙型肝炎患者細胞免疫功能影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年8月‐2017年12月收治的慢性乙型肝炎患者90例作為觀察組，選取同期在本院進行正常體檢的健康者40例作為對照組。兩組均自愿簽署知情同意書，兩組一般資料方面差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較 （±s）

表1 兩組一般資料比較 （±s）

組別 例數 性別/例 平均年齡/歲 平均體重/kg男 女對照組 40 23 17 40.33±8.19 68.96±18.63觀察組 90 56 34 40.27±8.24 70.58±19.52 χ2/t值 0.259 0.038 0.443 P值 0611 0.969 0.659

1.2 方法

患者入院后，采集清晨空腹靜脈血5 ml，并應用無熱源試管收集，2 h內分離血清，置于-70℃凍存待測。①ET的檢測：選用上海伊華科技公司的試劑盒，采用顯色基質法鱟試驗去熱源處理所有器材，在試管中分別加入0.05 ml鱟試劑和0.05 ml樣品，搖勻后置入37℃水溶25 min，再將0.05 ml鱟試劑水溶于37℃水中3 min，取出后加入萘乙二胺、氨基磺酸銨以及亞硝酸溶液各0.05 ml，搖晃均勻后于545比色讀數，按照公式A=As-（Ab-Abb），求得吸光度A值，對應內毒素標準曲線求內毒素含量。②T淋巴細胞的兩個亞群CD4+和CD8+的檢測：采用聚蔗糖-泛影葡胺分離液分離外周血淋巴細胞，對細胞進行分離時，在分層液上疊加肝素抗凝全血，使兩者形成一個清晰的界面，水平離心后形成不同層次細胞區帶和液體，從而將外周血淋巴細胞分離出來。層液的密度遠小于紅細胞和粒細胞，沉積于分層液底部的外周血淋巴細胞密度在1.076～1.090，與分層液密度相比略低，因而主要位于分層液和血漿層的界面中，呈白膜狀，然后將單個核細胞吸出，苔盼藍染色計數。采用美國BD公司生產的流式細胞儀檢測CD4+和CD8+的含量，首先將外周血淋巴細胞調整至1.0×106/ml，取100 μl細胞懸浮液，加入美國BD公司生產的100 μl PE或FITC標記的單克隆抗體，放置在避光的地方染色0.5 h，采用鄭州大學醫學院第二附屬醫院消化研究所提供的試劑PBS 3%多聚甲醛淋巴固體液洗滌兩次，將未結合的抗體去除，檢測CD4+和CD8+的含量。③TNF-α、IL-2的檢測：采用酶聯免疫吸附試驗法進行檢測，試劑盒由上海瓦蘭生物科技有限公司提供。

1.3 觀察指標

比較兩組血漿內毒素（endotoxin, ET）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素（interleukin-2, IL-2）以及T淋巴細胞的兩個亞群CD4+和CD8+數目。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行數據處理。以均數 ±標準差（±s）表示兩組ET、TNF-α、IL-2以及T淋巴細胞的兩個亞群CD4+和CD8+數目，采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組ET、TNF-α、IL-2水平比較

和對照組相比，觀察組ET和TNF-α水平明顯更高，而IL-2水平明顯更低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 兩組ET、TNF-α、IL-2水平比較 （±s）

表2 兩組ET、TNF-α、IL-2水平比較 （±s）

組別 例數 ET/(pg/ml) TNF-α/(ng/ml) IL-2/(ng/ml)對照組 40 0.28±0.20 20.76±5.68 62.60±14.87觀察組 90 0.39±0.02 56.78±10.19 26.60±14.87 t值 5.185 20.929 12.740 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組T淋巴細胞亞群比較

對照組CD4+和CD4+/CD8+比值明顯高于觀察組，CD8+明顯更低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組T淋巴細胞亞群比較 （±s）

表3 兩組T淋巴細胞亞群比較 （±s）

組別 例數 CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對照組 40 42.87±7.56 31.20±5.37 1.39±0.39觀察組 90 34.37±6.36 35.25±5.36 0.94±0.34 t值 6.628 3.974 6.652 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

急性病毒性肝炎患者能夠成功地清除病毒是由于細胞毒性T細胞對病毒編碼抗原的反應，但對于慢性乙型肝炎患者，這一反應明顯減弱，致使病毒難以清除，主要受細胞免疫功能的影響[6-7]。因此，有學者提出治療乙型病毒性肝炎應在進行抗病毒治療的同時，解決細胞免疫力低下的問題[8]。慢性乙型肝炎是臨床上常見病和多發病，嚴重危害患者健康，乙型肝炎病毒不能被清除是乙型肝炎進展的主要原因之一[9]。因此，采取何種措施抑制乙型肝炎病毒復制，并有效清除是阻止疾病進展的關鍵。大量研究表明[10]，乙型肝炎病毒感染中病毒并沒有對肝造成損傷，宿主因素在疾病的發展和轉歸中發揮著重要的作用，特別是細胞免疫功能方面。

本研究結果顯示，對照組IL-2、CD4+和CD4+/CD8+水 平 高 于 觀 察 組，ET、TNF-α 和CD8+水平明顯低于觀察組，表明慢性乙型肝炎患者的ET水平明顯升高，細胞免疫功能明顯降低。ET是革蘭氏陰性細菌的細胞壁成分，正常情況下，腸道內革蘭氏陰性細菌不斷釋放ET，但腸黏膜上皮細胞對ET具有較強抵抗力，使ET難以通過腸黏膜屏障入血，即使少量ET進入肝臟后經肝臟枯否氏細胞解毒而清除。腸源性內毒素血癥的發病原因主要為以下幾點：①對于慢性乙型肝炎患者，由于腸內黏膜淤血、腸桿菌科細菌過度生長，再加上腸道菌群紊亂，增加ET的吸收；②因肝臟受損，進一步降低枯否氏細胞對ET的清除能力，從而造成ET水平升高；③機體細胞免疫功能下降，ET在對肝臟枯否氏細胞進行激活時，會導致大量的氧自由基產生，和其引起的脂質過氧化反應對細胞免疫功能有很大的影響，此外，內毒素可有效減弱淋巴細胞對有絲分裂原刺激的反應，改變輔助型淋巴細胞與抑制型淋巴細胞的比例，降低IL-2含量及自然殺傷細胞活性，從而降低細胞免疫功能，同時ET可刺激單核巨噬細胞產生TNF-α等多種細胞因子，不僅可以對ET的多種生物學作用進行介導，還可以使肝臟產生炎癥反應。正常情況下，T淋巴細胞亞群比例保持平衡，可維持正常免疫功能，但出現比例失衡時，會導致免疫功能紊亂，產生一系列的病理生理變化。CD4+亞群的降低和CD8+亞群的上升，分別代表免疫應答的正反饋作用的減弱以及負反饋作用的增強，進而導致免疫功能的降低。IL-2是免疫系統中的一類細胞生長因子，由Th1細胞分泌，在機體免疫調節中具有重要作用。IL-2可激活自然殺傷細胞活性，增加Th細胞數量，從而增強機體免疫功能。此外，IL-2還可和TNF-α等細胞因子形成動態免疫調節網絡，以維持正常免疫調節功能。因此，IL-2可反映機體免疫功能，其水平的下降，直接影響肝炎病毒的清除及T細胞的增殖。由此可見，對于乙型肝炎患者的治療應降低高水平的內毒素血癥，提高患者免疫功能，從而有利于修復肝臟損傷和清除肝炎病毒。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者體內ET水平明顯升高，細胞免疫功能低下紊亂。