告達庭衍生物抑制人乳腺癌細胞增殖及其作用機制研究

1.衢州職業技術學院醫學院，浙江 衢州 324000；2.浙江醫藥高等專科學校，浙江 寧波 315100

乳腺癌是全球女性中最常見的腫瘤之一，其發病率居女性腫瘤之首，現已經成為影響女性健康最主要的原因[1]。據統計，2012年全球乳腺癌新增病例數約有167萬，占所有腫瘤的25%[2]。在中國女性當中，每年乳腺癌新增病例和死亡病例分別占到全世界的 12.2%和9.6%[3]，所以乳腺癌的診斷和治療顯得尤為重要。目前乳腺癌最常見的治療手段為手術、放化療、內分泌和靶向藥物治療，但是由于乳腺癌自身特點術后易引起復發且大多數藥物會產生極大的副作用和耐藥[4-5]，尋求新的、高效低毒的治療乳腺癌的藥物變得尤為重要。

中藥在綜合治療癌癥方面取得了良好的療效，越來越受到相關研究者的關注[6]。白首烏為蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)的干燥塊根，是傳統的補益中藥。中醫理論認為，白首烏具有補肝腎、強筋骨、黑須發及延年益壽等功效，藥理研究表明，白首烏具有抗衰老、抗炎、抗腫瘤、增強免疫、保肝等活性。白首烏的主要活性成分為C21甾體苷類化合物，許多研究表明其具有良好的抗腫瘤活性[7-10]。而告達庭(Caudatin)為C21甾體苷元，可從白首烏中分離得到。據研究報道，告達庭對人胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤均具有明顯的抑制作用[11-13]。在生物體中告達庭主要以糖苷的形式存在，本研究在前人研究基礎上，探討告達庭衍生物，告達庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(告達庭-3-O-β-D-吡喃磁麻糖苷，caudatin-3-O-β-D- cymaropyranoside)，對人乳腺癌細胞抗腫瘤活性及相關的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 細胞株 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MCF-7購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 藥物 告達庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)自制，取耳葉牛皮消的塊根，粉碎,80%乙醇溶液滲漉提取，減壓濃縮成浸膏。加水混懸，用乙酸乙酯萃取，濃縮萃取液，進行硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(體積比80∶1→5∶1)梯度洗脫，流分經硅膠柱色譜和HPLC制備，得Ca-G，純度>98%，配制成10 mg/ml的母液，溶劑為DMSO，于-20 ℃分裝保存。

1.3 試劑 胎牛血清、DMEM培養液購自美國Invitrogen公司；DMSO、MTT購自美國Sigma公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，、PI/RNase細胞周期檢測試劑盒、Annexin-V-FITC/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；anti-cyclin D1、anti-β-tubulin購自美國Cell Signaling Technology公司；horseradish peroxidase conjugated secondary antibodies (二抗)購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，MCF-7培養于完全DMEM培養基中(含10%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，細胞呈貼壁生長，密度達90%左右時進行傳代。

2.2 MTT法測定細胞活力 收集對數生長期的MDA-MB-231，MCF-7細胞，經胰酶消化并離心后，調整細胞懸液濃度，以3×103個/孔的密度接種于96孔培養板，每孔100 μL。置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h，待細胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G，濃度梯度設置為1、20、40、80 μg/mL，另外設置溶劑對照組(不加藥，加入DMSO)和空白調零組(只加培養液、不加細胞和藥物)，均設4個復孔，繼續培養 48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h，吸凈孔內液體，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩10 min，使藍紫色結晶物甲瓚充分溶解，用酶標儀于570 nm處測各孔吸光度(OD)值，并計算相對細胞存活率。相對細胞存活率(%) =(給藥孔-空白調零孔/對照孔-空白調零孔)×100%。

2.3 細胞周期 收集對數生長期的MDA-MB-231，MCF-7細胞，經胰酶消化并離心后，調整細胞懸液濃度，接種于6 cm的培養皿中，細胞密度為6×105個/皿，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。待細胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培養箱中孵育48 h后，收集各組細胞，消化，離心，每組加入1 mL的PBS用來洗滌細胞，并用70%乙醇進行固定，置于-20 ℃過夜。取出固定好的細胞懸液用PBS洗滌細胞兩次，按照PI/RNase細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作，每1×106個細胞沉淀中加入500 μL的PI/RNase染液，避光，染色15 min。染色完成后，上機檢測實驗結果采用flowjo軟件進行分析處理。

2.4 細胞凋亡 收集對數生長期的MDA-MB-231，MCF-7細胞，接種于6 cm的培養皿中，細胞密度為6×105個/皿，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。待細胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培養箱中孵育48 h后，收集各組細胞，經PBS洗滌后，按照Annexin-V-FITC/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，每1×106個細胞沉淀中加入500 μL的PI/RNase染液，避光，染色15 min。染色完成后，上機檢測實驗結果采用flowjo軟件進行分析處理。

2.5 Western blotting 收集對數生長期的MDA-MB-231，MCF-7細胞，經胰酶消化并離心后，調整細胞懸液濃度，接種于6 cm的培養皿中，細胞密度為6×105/皿，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。待細胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培養箱中孵育48 h后，收集各組細胞。加入適量RIPA裂解液裂解。按照碧云天BCA蛋白含量測定試劑盒說明書檢測樣品蛋白含量，按BIO-RAD說明書方法配制分離膠，濃縮膠，上樣，進行SDS-PAGE電泳、轉膜，封閉，孵育一抗，過夜。并加入二抗，按照ECL顯影液試劑盒說明書，放入化學發光成像系統，曝光。

3 結果

3.1 Ca-G對乳腺癌細胞活力的影響 MTT結果顯示不同濃度的Ca-G給藥48 h后，加藥組乳腺癌細胞株的活力均明顯降低，且呈一定的劑量依賴性(P<0.001)。如圖1所示。

3.2 Ca-G對細胞周期的影響 由于Ca-G對MDA-MB-231，MCF-7細胞的生長具有顯著的抑制作用，且細胞周期阻滯是影響細胞生長進程的關鍵因素之一。推測Ca-G可能對細胞周期具有調節作用，因此采用流式細胞術檢測了Ca-G對細胞周期的影響。Ca-G作用MDA-MB-231，MCF-7細胞48 h后，G1期細胞數量顯著增加，而 G2期細胞數目則減少，說明Ca-G可使乳腺癌細胞阻滯于細胞周期G1期。見圖2、表1。

MDA-MB-231 MCF-7 Ca-G G1SG2G1SG20μg/mL47.52±0.7218.23±0.4634.25±0.2855.82±0.5426.23±0.3917.95±0.1615μg/mL58.46±1.08***25.58±0.9415.96±2.0063.31±1.00***21.86±0.8114.83±1.4530μg/mL62.92±0.30***24.25±0.5112.63±0.8175.13±0.60***12.52±0.4612.34±0.68

3.3 Ca-G對細胞周期關鍵蛋白表達水平的影響 cyclin D1可推動細胞周期由G1時期進入到S時期，在細胞周期G1期起到關鍵作用，所以本研究檢測了cyclin D1蛋白表達。Ca-G能夠明顯下調乳腺癌細胞中cyclin D1的蛋白表達水平，說明Ca-G可能是通過抑制cyclin D1的表達引起乳腺癌細胞阻滯于細胞周期G1期。如圖3所示。

3.4 Ca-G對細胞凋亡的影響 除細胞周期外，細胞凋亡也是抗腫瘤藥物常見的作用機制之一。推測Ca-G可能對細胞凋亡具有調節作用，并采用流式細胞術檢測了Ca-G對細胞凋亡的影響。Ca-G作用MDA-MB-231，MCF-7細胞48 h后，Ca-G呈劑量依賴性地引起MDA-MB-231，MCF-7細胞凋亡比例升高，在劑量為30 μg/ml時，凋亡比例分別為(MDA-MB-231)和(MCF-7)，說明Ca-G一定程度誘導乳腺癌細胞產生凋亡。見圖4、表2。

表2 Ca-G對乳腺癌細胞凋亡的影響

MDA-MB-231 MCF-7 Ca-G正常細胞凋亡細胞死亡細胞正常細胞凋亡細胞死亡細胞0μg/mL98.94±0.760.71±0.340.35±0.5394.57±0.870.12±0.045.31±0.8715μg/mL91.75±1.277.74±0.95***0.51±0.7587.16±3.1212.31±2.80***0.53±0.4430μg/mL60.91±2.0337.41±1.33***1.68±0.7152.22±2.8645.78±1.96***2.00±0.97

3.5 Ca-G對細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響 研究表明caspase蛋白被激活是細胞凋亡產生的標志性事件。凋亡起始者caspase9/8被激活后，進一步激活下游凋亡執行蛋白如caspase3/7等，最終導致凋亡。本研究檢測了Ca-G作用后caspase相關蛋白的變化，結果發現caspase 9, caspase 7表達升高。說明Ca-G誘導的乳腺癌細胞凋亡可能是通過激活caspase信號通路。如見圖5所示。

4 討論

中藥因其不易產生耐藥、毒副作用低等優點，在治療癌癥方面越來越受到研究者的青睞，許多用于臨床的藥物，如紫杉醇、羥基喜樹堿等都是直接或間接來源于中藥[14-16]。白首烏中C21甾體苷在體內外研究中，均具有良好的抑制腫瘤作用，告達庭作為其中一種苷元也起到一定抗腫瘤作用，但是其含量較低。告達庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)是以告達庭為苷元形成的一種糖苷類化合物。很少報道其是否具有抗腫瘤作用。本研究通過MTT實驗發現，Ca-G能夠劑量依賴性地抑制乳腺癌細胞的增殖。

腫瘤細胞最常見的特點是迅速、無限增殖。細胞周期調控紊亂是腫瘤細胞異常增殖最常見且最基本的機制之一，為了檢測Ca-G抑制乳腺癌細胞增殖是否和細胞周期的調控有關，本研究采用流式細胞術進行檢測，結果發現，Ca-G作用后G0/G1期細胞數明顯增多，說明Ca-G可誘導乳腺癌細胞阻滯于細胞周期G0/G1期。細胞周期是由大量細胞周期調控蛋白參與的復雜過程。其中cyclin D1是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白，可通過結合并激活細胞周期蛋白依賴性激酶，促使G1期向S期的轉變[17]。本研究結果表明，Ca-G能夠抑制MDA-MB-231和MCF-7細胞內cyclin D1 的表達，可能與阻滯細胞周期G0/G1期相關。

細胞凋亡也是抗腫瘤藥物常見的作用機制之一，為了檢測Ca-G抑制乳腺癌細胞增殖是否和細胞凋亡有關，本研究采用流式細胞術進行檢測，結果發現Ca-G作用乳腺癌細胞后，細胞凋亡比例明顯升高。研究表明caspase蛋白被激活往往是細胞凋亡產生的標志性事件。文獻報道，有兩條經典的依賴caspase信號通路誘導細胞凋亡，分別是死亡受體介導的外源性途徑和線粒體介導的內源性途徑。無論是通過外源性或內源性途徑，目的都是通過激活凋亡起始者caspase 9或caspase 8，進一步激活下游凋亡執行蛋白如caspase 3或caspase 7等，最終導致凋亡[18-19]。有文獻報道在乳腺癌MCF-7細胞中不表達caspase 3[20]，所以本研究檢測了caspase 7代替caspase 3。結果發現caspase 9、 caspase7表達均升高，說明Ca-G通過激活內外兩條途徑，激活caspase信號通路，導致三陰性乳腺癌細胞凋亡總之，告達庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷可有效抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MCF-7的增殖活性，其機制可能與細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡有關。這為告達庭及其衍生物抗腫瘤作用的進一步研究提供一定的實驗基礎，也為綜合開發C21甾體苷類化合物的臨床應用提供一種思路。