扶正化瘀抗纖方對肝硬化大鼠TGF-β1及PDGF表達的研究

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1.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

肝硬化(hepatic cirrhosis)[1-2]是由一種或多種原因引起的、以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結節為組織學特征的進行性慢性肝病，是肝臟疾病發展到中后期的必然結果，早期無明顯癥狀，后期因肝臟變形變硬、導致肝小葉結構和血液循環途徑顯著改變，破壞和假小葉形成，及血管重建，肝臟逐漸變形、縮小、變硬而發展為肝硬化。肝纖維化[3](hepatic fibrosis，HF)是指由于各種致病因子致肝內結締組織異常增生，肝內細胞外基質廣泛過度沉積的一種病理過程，是所有慢性肝病的病理基礎。肝纖維化[4-5]是慢性肝病的重要病理特征，是疾病發展成為肝硬化的一個必經階段。目前，大量研究報道疾病在肝纖維化階段是可以逆轉的[6-7]。因此，在肝纖維化階段能否阻斷其繼續發展，甚至逆轉肝臟病理變化，從而防止或延緩肝硬化的發生、阻止肝癌進一步形成，具有十分重要的臨床意義。TGF-β1和PDGF是肝臟形成纖維化過程中較為關鍵的細胞因子。導師廖志峰在臨床上治療早期肝硬化多用扶正化瘀抗纖方進行加減，并取得滿意療效。本次實驗擬通過觀察扶正化瘀抗纖方對肝硬化大鼠肝臟組織中TGF-β1、PDGF表達的影響，以探索其可能的作用機制，為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 動物 SD大鼠40只，SPF級，雄性，體重(200±20) g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號為SYXK(甘)2011-0001。分籠飼養于甘肅中醫藥大學動物實驗中心，SPF級，適應性飼養7 d，飼以標準的大鼠合成飼料，自由飲用純凈水，環境溫度( 22±2)℃，相對濕度40%～60% 。

1.2 藥物與試劑 扶正化瘀抗纖方基礎方：丹參30 g，蟲草1 g，桃仁10 g，生黃芪30 g，水蛭3 g，大黃10 g，由甘肅省中醫院中藥房提供；按組方稱取藥材，用蒸餾水煎煮藥液 3 024 mL(共6周藥量)，真空包裝后置冰箱4℃冷藏。熊去氧膽酸片(國藥準字：H31021950，規格50 mg/片，上海中西三維制藥有限公司)使用時以滅菌缽體研磨至細末，蒸餾水配制濃度54 g/L混懸液 1 480 mL(共6周藥量)，使用前充分搖勻。四氯化碳(批號：20120128，天津富宇精細化工有限公司)；橄欖油(批號：GB 23347，山東魯花集團有限公司)；食用酒精(衛生許可證號：5449419807，北京紅星股份有限公司)；I抗TGF beta1 Antibody、PDGFA Antibody(批號：P01137、P04085，甘肅瑞德生物科技有限公司)；II抗Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)HRP(批號：S0001，甘肅瑞德生物科技有限公司)。

1.3 儀器 臺式高速冷凍離心機(德國Heraeus公司)；光學顯微鏡(日本 Olympus 公司)；電泳槽、電泳儀：北京六一；恒溫式冷凍切片機(德國LEICA公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥 大鼠常規適應性喂養1周后，隨機將動物分為對照組、模型組、扶正化瘀抗纖方組及熊去氧膽酸組，每組各10只大鼠。其中，對照組喂養正常大鼠飼料及飲水，模型組按照經典復合因素并加以改進制備肝硬化模型[8-9]，不進行任何治療。造模成功的標志大體上觀察可見大鼠毛發凌亂無光澤，食欲較差，精神萎靡活動少，對外界刺激反應變慢，體重較正常組相比較明顯下降，尸檢部分大鼠可見腹水形成，部分可見肝臟表面小結節形成，鏡下觀察可見纖維組織增生和假小葉形成；藥物劑量以成人用藥(60 kg體重)按照實驗動物體形系數換算法計算，得扶正化瘀抗纖方劑量及熊去氧膽酸劑量。治療組在造模成功后即予相應藥物干預。除對照組外，其余各組均采用30%酒精為唯一飲料，皮下注射CCl4(首次劑量給予5 mL/kg，以后每隔3 d皮下注射40%CCl4油劑3 mL/kg)，予加入0.5%膽固醇的高脂飼料喂養，連續6周成模。

對照組及模型組用等量生理鹽水灌胃，扶正化瘀抗纖方組按成人用藥有效劑量換算為18.9 g/kg。熊去氧膽酸組成人用藥量為10 mg/kg/d，按成人體重60 kg估算，成人每天用藥劑量6 g，按0.018換算系數計算大鼠等效劑量為0.54 g/kg，分別灌胃治療干預。

2.2 取材 治療6周后分別處死動物取材，取材前1天下午5點后禁食不禁水。于當日上午8點開始，各組大鼠稱重后麻醉(按照3.5 mL/kg體重的標準腹腔注射10% 水合氯醛) ，剖腹后腹主動脈采血，4℃靜置3 h ，4 000 r/min離心10 min，分離血清；采血后摘取大鼠肝臟，用濾紙吸取血液，生理鹽水沖洗干凈，取肝臟右葉同一部位約1 cm×1 cm×0.5 cm大小的肝臟組織放入4%多聚甲醛液中固定，以制作病理切片；再取肝臟右葉1 cm×1 cm×1 cm大小的新鮮肝臟組織放入凍存管內，置-80℃ 超低溫冰箱保存，用于 RT-PCR備檢。

2.3 肝臟組織病理學檢查及評分 取于4% 多聚甲醛中固定24 h后的大鼠肝臟，流水沖洗30 min，然后剪成組織大小約3 mm×2 mm×3 mm，各級酒精梯度脫水，二甲苯三級透明，浸蠟包埋，石蠟切片機切片、粘片及烤片后HE染色，HE 染色步驟參照試劑盒說明書。根據《肝臟病理診斷學》[10]標準，肝纖維化程度可分為4期：0期無病理變化；1期匯管區纖維擴大，限小葉內纖維化；2期匯管區纖維化，纖維間隔形成，肝小葉結構存在；3期纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；4期為早期肝硬化。

2.4 RT-PCR法測定肝臟組織TGF-β1mRNA、PDGFmRNA的表達引物設計 TGF-β1擴增條件：95℃預變性3 min，95℃50 s變性，退火溫度58℃，45 s，72℃，60 s反應，40個循環，最后60℃延伸10 min，擴增長度為391 bp；PDGF擴增條件：94℃預變性5 min，94℃30 s變性，退火溫度58℃，30 s，72℃，60 s反應，40個循環，最后60℃延伸5 min，擴增產物長度為284 bp；GAPDH擴增條件：94℃預變性3 min，94℃40 s變性，退火溫度59℃，50 s，72℃，90 s反應，30個循環，最后60℃延伸10 min，長度584 bp。

NameSequence(5'-3')SizeGAPDH-F5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'22GAPDH-R5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'21TGF beta'-F5'-CAACAATTCCTGGCGTTACCT-3' 21TGF beta 1-R5'-AAAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3'21PDGF a-F5'-CTGAGGATGCCTTGGAGACAAAC-3'23PDGF a-R 5'-TCTTGCAAACTGCGGGAATG-3'20

3 結果

3.1 大鼠一般狀況 在實驗各組中，對照組大鼠的一般狀態良好，能夠正常進食及飲水，毛色光澤，活動、反應靈敏，排尿正常，排便呈麥粒狀。余實驗各組在造模過程中，飲用30%食用酒精飲料后出現暫時的興奮，后精神欠佳，進食和活動逐漸減少；模型組大鼠毛色蓬亂缺少光澤，體型消瘦，煩躁易怒，弓背喜臥，精神不振，大便較稀，飲食和進水均劣于其他各組；熊去氧膽酸組和扶正化瘀抗纖方組精神、進食方面較模型組好，上述情況較輕，其中扶正化瘀抗纖方組中的大鼠優于熊去氧膽酸組。

3.2 大鼠肝臟組織病理學觀察 對照組大鼠的肝小葉結構清晰，細胞胞質豐富，大小排列均勻，竇狀間隙未見擴張，肝板結構清楚，呈條索狀，由中央靜脈向外放射性分布，匯管區無炎性浸潤；模型組肝細胞索排列紊亂，肝小葉結構破壞明顯，匯管區增大，肝細胞可見不同程度的壞死以及較為廣泛脂肪變性，細胞內可見多發炎性浸潤，細胞腫脹，排列擁擠，部分區域可見空泡，并有廣泛的纖維增生，部分纖維間隔形成；扶正化瘀抗纖方組部分可見細胞空泡或脂肪變性，可見纖維增生，未見纖維間隔形成；熊去氧膽酸組肝小葉結構基本存在，有部分細胞腫脹變性，病變區域較少，炎性浸潤明顯少于模型組。如圖1所示。

3.3 大鼠肝纖維化程度 各組大鼠肝纖維化程度結果顯示：對照組中沒有肝纖維化發生，模型組大鼠均有不同程度的肝纖維化及出現早期肝硬化征象；扶正化瘀抗纖方組和熊去氧膽酸組肝纖維化發生程度差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同時期大鼠肝纖維化程度

3.4 RT-PCR檢測肝組織中TGF-β1mRNA及PDGF mRNA的表達 RT-PCR結果顯示：對照組大鼠肝組織TGF-β1mRNA有少量表達，與各組相比，模型組中TGF-β1mRNA表達量顯著增多(P<0.01)，各治療組與模型組相比表達量明顯下調，以扶正化瘀抗纖方組與模型組相比下降最為明顯(P<0.01)，熊去氧膽酸組表達優于各模型組(P<0.05)。對照組大鼠肝組織PDGFmRNA有少量表達，模型組的表達含量明顯高于扶正化瘀抗纖方組和熊去氧膽酸組(P<0.05)。見表2。

組別TGF-β1mRNAPDGF mRNA對照組0.958±0.0421.011±0.179模型組4.136±0.141*5.124±0.448*扶正化瘀抗纖方組1.518±0.144△◇2.023±0.090△◇熊去氧膽酸組2.148±0.194△#2.094±0.169△#

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與中藥扶正化瘀抗纖方組比較，#P<0.05；與熊去氧膽酸組比較，◇P<0.05。

4 討論

復合致病因素利用CCl4慢性中毒，高脂肪、高膽固醇、高醇飲食等因素導致肝臟發生炎癥，逐漸形成肝纖維化并最終發展成為肝硬化，與臨床上多種慢性肝病最終發展為肝硬化相符合[11]。肝纖維化是多種肝臟疾病的結果，肝纖維化主要是由于肝臟組織中細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的合成與降解失衡所造成。研究表明，TGF-β1在參與調控活化的細胞因子中，能夠明顯抑制肝組織正常細胞的增殖，激發肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化以促進ECM的產生，并可調節肝細胞的凋亡，是細胞因子中導致肝纖維化最強有力的[12]。

在HSC激活的早期，PDGF表達的增加是其重要標志，實驗研究發現PDGF及其受體在肝纖維化發生發展中的表達明顯高于正常的肝組織，并且其活性隨肝纖維化的程度加重而升高，呈正相關[13]，因此也是肝纖維化形成過程中關鍵的細胞因子。目前大多數學者認為肝纖維化的形成機制是由于肝臟組織和細胞受到炎癥刺激或發生變性壞死時，肝臟中蛋白多糖、膠原等ECM的合成大于降解，使肝臟纖維組織過度沉積。其中HSC的活化可導致大量ECM的合成，是形成肝纖維化的中心環節[14]。若進一步發展，則可合并肝小葉結構的改變、再生結節及假小葉的形成，最終發展為肝硬化(liver cirrhosis,LC)。因此，如何治療甚至逆轉肝纖維化是治療肝臟疾病的重要環節，而TGF-β1、PDGF是目前發現的重要致肝纖維化因子，在HSC活化、增殖及形成ECM的過程中發揮著重要的調控作用。

眾多研究發現表明，慢性肝病、肝纖維化的中醫病理改變中以正虛血瘀、濕熱瘀毒為主[15-18]。而扶正化瘀抗纖方為導師廖志峰主任醫師臨床治療肝纖維化、肝硬化的經驗方，是由生黃芪、桃仁、丹參、水蛭、大黃、蟲草組成的基本方，臨床運用多以此隨證加減。其中桃仁、水蛭破血逐瘀，軟堅散結為君藥，生黃芪、冬蟲夏草補虛損、益精氣，丹參活血化瘀，大黃蕩滌積滯共為臣藥，合方共奏破血逐瘀，補氣散結，軟堅消積之功效，臨床加減運用此方已經取得療效確切[19]。本實驗進一步證實扶正化瘀抗纖方可明顯抑制TGF-β1 、PDGF在肝纖維化發展過程中的表達，提示其作用機制可能與抑制致纖細胞因子的表達、減少肝星狀細胞的激活，從而減少肝組織中的細胞外基質沉積有關，最終減緩了肝纖維化的發展進程。