過氧化物酶體增生物激活受體激活物對ox—LDL誘導內皮細胞c—fos表達的影響

祝河忠 陳佳娟 童學影

摘 要：目的 觀察過氧化物酶體增生物激活受體α激活物K877對氧化型低密度脂蛋白所誘導的人臍靜脈內皮細胞c-fos基因表達的影響及機制。方法 體外培養人臍靜脈內皮細胞，采取氧化型低密度脂蛋白刺激，應用K877干預，逆轉錄聚合酶鏈反應檢測c-fos基因的表達。結果 與對照組比較，氧化型低密度脂蛋白組c-fos基因表達增加（P<0.05）；與氧化型低密度脂蛋白組比較，K877組c-fos基因表達減少（P<0.05）；與K877組比較，K877聯合多聚肌甘酸c-fos基因表達進一步下降（P<0.05）。結論 氧化低密度脂蛋白促進了人臍靜脈內皮細胞c-fos基因的表達，過氧化物酶體增生物激活受體α激活物K877可抑制c-fos基因的表達，血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1參與了該過程。

關鍵詞：內皮細胞；c-fos；氧化型低密度脂蛋白；過氧化物酶體增生物激活受體

中圖分類號：R543.5 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.20.017

文章編號：1006-1959（2018）20-0058-03

Abstract：Objective To observe the effect and mechanism of peroxisome proliferator-activated receptor α activator K877 on c-fos gene expression in human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein.Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro，stimulated with oxidized low density lipoprotein，and K877 was used for intervention. Reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the expression of c-fos gene.Results Compared with the control group，the expression of c-fos gene was increased in the oxidized low density lipoprotein group（P<0.05）.Compared with the oxidized low density lipoprotein group，the expression of c-fos gene was decreased in the K877 group（P<0.05）.Compared with the K877 group，the expression of K877 combined with poly-clinic acid c-fos gene was further decreased（P<0.05）.Conclusion Oxidized low density lipoprotein promotes the expression of c-fos gene in human umbilical vein endothelial cells.Peroxisome proliferator-activated receptor α activator K877 can inhibit the expression of c-fos gene and hemagglutinin-like oxidation.Low density lipoprotein receptor 1 is involved in this process.

Key words：Endothelial cells；c-fos；Oxidized low density lipoprotein；Peroxisome proliferator-activated receptor

氧化低密度脂蛋白在內皮細胞損傷中起重要作用，內皮細胞的損傷啟動粥樣硬化，誘導斑塊的形成。內皮細胞損傷的機制復雜眾多[1]，其中細胞增殖分化可引起血管內壁在形態結構穩定、代謝、生長、信號傳遞等方面出現紊亂，引起動脈粥樣硬化事件的發生[2]，如急性冠脈綜合征、腦卒中等，因此，探討氧化低密度脂蛋白在內皮細胞損傷機制對動脈粥樣硬化的防治具有重要的意義。本文選擇人工培養人臍靜脈內皮細胞，經氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）氧化處理，觀察高選擇性過氧化物酶體增生物激活受體α激活物（PPARα，K877）[3]對c-fos基因表達的影響及探討血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（Lox-1）與該過程是否有關，進而探討內皮細胞損傷的相關機制及K877在動脈粥樣硬化中有利作用。

1材料和方法

1.1材料 本課題自2017年1月～10月在十堰市太和醫院中心實驗室完成。人臍靜脈來自新生兒臍帶，標本取自健康的剖宮產產婦；藥品與試劑M199培養基、Ⅱ型膠原酶、0.25%胰酶-EDTA（美國Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青）、青霉素（齊魯制藥有限公司，批號：F7072308，規格：160萬IU）、鏈霉素（華北制藥股份有限公司，批號：170726，規格：100萬IU）、多聚肌苷酸（上海遠慕生物科技有限公司，批號：30918-54-8，規格：1.0 g）、Trizol試劑盒（美國Gibco公司），明膠（美國MP公司），內皮細胞生長因子和Lowry's試劑盒（美國Sigma公司）；兔抗人Ⅷ因子抗體（博奧森公司），過氧化物酶體增生物激活受體α激活物K877（上海皓元生物醫藥科技有限公司，批號E124537，規格10 mg），RT-PCR試劑盒（加拿大Fermentas公司）。主要儀器：二氧化碳培養箱（英國Cecil公司，型號18517C）、臺式冷凍離心機（軍事醫學科學院實驗儀器廠，型號TLL-D）、培養瓶（美國Corning公司，型號J00751）。

1.2氧化低密度脂蛋白的制備 分離低密度脂蛋白采用一次性密度梯度超速離心法。血漿來自十堰市中心血站血庫。血漿于4 ℃、50000 r/min離心5 h。分離出的LDL在4 ℃的LDL透析36 h，無菌保存。用Lowry's法測定LDL的蛋白含量。把已氧化的LDL在無EDTA的PBS（0.01 mol/L，pH=7.4）中4 ℃透析36 h，然后加入含CuSO4 PBS液，使Cu2+的終濃度為5.00 μmol/L，37 ℃氧化18 h。氧化結束后置于含200.00 μmol/L EDTA 的PBS液中透析24 h，并于4 ℃避光保存。用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定LDL和ox-LDL的純度，硫代巴比妥酸反應法測定LDL和ox-LDL的丙二醛含量以確定其氧化修飾程度。

1.3人及靜脈內皮細胞的培養及分組 無菌條件下擠出臍帶血管中的血液，放入滅菌的含雙抗的PBS瓶中，行細胞培養。取第4、5代亞匯合狀態的HUVEC分組進行后續實驗。含0.1% FBS M199組為空白對照組。①對照組：普通培養基；②ox-LDL組：培養基中加入終濃度50 μg/ml ox-LDL培養24 h；③K877組：0.2 μmol/L K877預先作用內皮細胞2 h，再加入終濃度為50 μg/ml ox-LDL培養24 h。④K877+多聚肌甘酸組：終濃度250 μg/ml多聚肌甘酸預先作用內皮細胞2 h，再加入終濃度0.2 μmol/L K877預先作用內皮細胞2 h，最后加入終濃度為50 μg/mL ox-LDL培養24 h。

1.4檢測c-fos基因的表達 引物由上海生物工程有限公司合成，逆轉錄聚合酶連反應檢測的c-fos mRNA表達，用Trizol試劑盒，提取細胞總RNA，核酸電泳鑒定未被降解。然后進行cDNA的PCR擴增。c-fos引物：上游5'-CAGACTACGAGGCGTCATCC-3'，下游5'-GACCGTGGGAATGAAGTTG-3'，擴增長172 bp。94 ℃預變性4 min。PCR反應條件：94 ℃變性20 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環。取擴增產物10 μl，電泳1.5 h，分析結果成像、條帶密度掃描，以β-actin為內參照，測定各組的c-fos mRNA相對量。

1.5統計學方法 采用SPSS16.0建立數據庫統計分析數據，計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1 c-fosmRNA的檢測 與對照組比較，ox-LDL組c-fos基因表達增加（P<0.05）；與ox-LDL組比較，K877組c-fos基因表達減少（P<0.05）；與K877組比較，K877組+多聚肌甘酸組c-fos基因表達進一步減少（P<0.05），見表1。

2.2人臍靜脈內皮細胞的鑒定 顯微鏡下觀察細胞形態、人第Ⅷ因子相關抗原的SP免疫組化證實培養的細胞為內皮細胞，見圖1、圖2。

3討論

ox-LDL對內皮細胞的損傷是動脈粥樣硬化的早期環節，已有的研究證實，內皮功能損傷與氧化應激、炎癥刺激、細胞凋亡、代謝紊亂等密切相關[4]；本研究體外培養內皮細胞，觀察到ox-LDL可誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡基因c-fos基因表達，原癌基因c-fos基因，是生物體內一種非常重要的基因，對細胞生長、分化、代謝、形態的穩定性起到重要的調控作用[5]，是內皮細胞損傷的重要生物標志物[6]。本研究結果顯示，c-fos基因在高濃度ox-LDL作用下表達明顯增加，提示內皮細胞過度增值分化是血脂異常致動脈粥樣硬化的機制之一，c-fos基因可能是動脈粥樣硬化早期生物標志物。

LOX-1與ox-LDL的代謝密切相關，主要表達于血管內皮細胞，具有多種生物學效應，介導內皮損傷信號轉導[7]。本實驗利用LOX-1的抑制劑多聚肌苷酸，阻斷LOX-1的介導作用，進一步觀察到ox-LDL對內皮細胞c-fos基因mRNA表達下調作用進一步被抑制，提示LOX-1也參入了ox-LDL誘導內皮細胞c-fos基因表達的過程。

ox-LDL在內皮細胞損傷、動脈粥樣硬化中扮演著重要的角色，盡管他汀類藥物在臨床上得到了廣泛的應用，但仍有部分患者并未從中獲益，因此，探討新的藥物治療，對不能從他汀類藥物獲益的患者有著重要的意義，K877是一種人工合成的具有高活性和高選擇性的過氧化物酶體增生物激活受體α（PPARα）的激活物，激活PPARα可以減輕炎癥反應、改善內皮細胞的功能，在抗動脈硬化的過程中發揮著重要作用[8]。國外Ⅲ期臨床研究顯示[9]，K877顯著降低TG和TC作用，在動物的藥代動力學實驗中也有很好的口服生物利用度以及低血漿清除率，K877組改善了肝臟酶，減少了對腎功能產生的不良反應。本研究顯示，K877可抑制ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞c-fos基因表達，提示激活PPARα受體是抗動脈粥樣硬化有效措施之一。

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收稿日期：2018-6-27；修回日期：2018-7-10

編輯/楊倩