乙型肝炎病毒HBx基因的shRNA重組表達載體的構建和鑒定

桑圣剛，王夢旖，肖 曼，杜冠魁

(海南醫學院 基礎醫學院，海口 571100)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一個重大的公共健康問題[1]. HBV是一種部分雙鏈的環狀DNA病毒，其負鏈DNA含有4個開放性閱讀框，分別稱為為S、C、X及P區，分別編碼表面抗原(HBsAg)、核心和分泌型抗原(HBcAg和HBeAg)、X蛋白(HBx)、多聚酶(HBV P)，這些蛋白在HBV的轉錄調節和DNA循環等環節中發揮重要的作用. 近幾年針對這幾個編碼框做了很多RNA的干擾研究工作. 其中，X區是最小的片段，約465 bp，所編碼的HBx蛋白具有反式激活功能，可以反式激活多種細胞及病毒啟動子和多種細胞原癌基因啟動子，因此在病毒復制和肝癌的形成中起著重要作用. HBV-X蛋白(HBx)是一個多功能調節蛋白，對基因轉錄、信號傳導、蛋白質降解、細胞周期和細胞凋亡等均具調節作用，HBx可能通過這些作用直接或間接調控HBV復制，并可能導致肝細胞癌變. 用小干擾RNA進行基因治療可能是抑制病毒表達和疾病進展的有效方法，而乙型肝炎病毒X基因(HBx)可能是此治療的最佳靶點[2].本研究以siRNA干擾技術構建HBx-siRNA的病毒表達，擬構建針對HBx基因短發夾小干擾RNA(Short hairpin RNA, shRNA)的表達質粒，為研究抗HBV的生物治療提供有力的工具和新的靶點.

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株及細胞系

載體pGenesil-3.1[攜帶紅色熒光蛋白(Ds-Red2)]、大腸桿菌株Trans5α和HepG2.2.15細胞系均由本實驗室保存.

1.2 主要試劑

Annealing Buffer for DNA Oligos (5×)、限制性內切酶Hind III、BamH I、Sal I，RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0、Trizol、Agarose D-5(TaKaRa)；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(生工生物工程公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根公司)；DMEM/HIGH GLUCOSE、Phosphate Buffered Saline (1×)(HyClone公司)；Trypsin EDTA Solution A、Fetal Bovine Serum(BI公司，以色列)；Trizma base、Tryptone、Yeast Extract(OXOID公司，英國)；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒(DOJINDO公司，日本)、TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金)、Accuri C6 flow cytometer (BD公司，美國)；其他化學試劑均為國產分析純試劑.

1.3 載體構建

根據GenBank中登錄的HBxmRNA基因序列(2182117)，同時參照Sergio Carmona的方法[3]U6 shRNA 5.2，

設計序列：

HBV1-A 5′-GATCCGGCACACGTGAAGCGAAGTGGAGTTCAAGACGCTCCACTTCGCTTCACGTGTGCCTTTTTGTCGACA-3′，

HBV1-B：5′-AGCTTGTCGACAAAAAAGGCACACGTGAAGCGAAGTGGAGCGTCTTGAACTCCACTTCGCTTCACGTGTGCCG-3′.

轉錄模板合成的引物結構：BamH I +Sense+Loop+Antisense+終止信號+SalI +Hind III. 用DEPC水溶解兩條shRNA引物，至終濃度為100 μmol/L的儲存液，各取10 μL與10 μL DEPC水混勻至50 μmol/L. 95 ℃退火反應體系，取退火產物1 μL與99 mL ddH2O混勻做100倍稀釋. 退火處理后的shRNA模板應用于連接反應. 稀釋過的退火片段與經過Hind III和BamH I酶切的pGenesil-3.1質粒載體連接，取25 μL過夜的連接產物，轉化感受態Trans5α，涂布于含有35 ng/mL卡那霉素的LB固體培養基上，37 ℃恒溫培養16 h；挑取單克隆菌落接種于10 mL含35 ng/mL卡那霉素的LB液體培養基中，于37 ℃ 250 r/min的恒溫搖床培養14 h，提取質粒，于-20 ℃保存備用.

1.4 細胞的培養及轉染

HepG2.2.15細胞復蘇，加入2.5 mL完全培養基，充分吹散細胞，吸至25T細胞培養瓶中，37 ℃恒溫、5%CO2條件下培養24 h，然后換液. 2～3 d后消化，加入200 μL無血清無雙抗培養基重懸細胞，細胞計數后，選擇適當比例與質粒混勻(質粒需10 μg)，將混合液加入電轉杯，并于4 ℃冰箱放置10 min后將電轉杯放入電轉儀，參數設置選擇為真核模式2個電脈沖、 脈沖時間200 μs、 電壓270 V. 電轉完成后立即加入15%FBS無雙抗培養基，在37 ℃恒溫、5%CO2條件下培養24 h后換新鮮的15%FBS無雙抗培養基. 24 h后換含有10%FBS與適量濃度G418的培養液繼續培養. 轉染48 h后用熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白的表達情況，并計算轉染率.

1.5 HBx基因mRNA轉錄水平的檢測

采用QRT-PCR法. 轉染48 h后的細胞，提取各組細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內參，擴增HBx基因. 根據文獻[4]得GAPDH與HBx定量引物序列(表1). 反應條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共45個循環.

表1 定量引物序列Tab.1 Quantitative primer sequences

1.6 CCK-8細胞增殖檢測

采用CCK-8細胞增殖檢測法. 將未轉染重組表達載體的HepG2.2.15細胞與已轉染重組表達載體的HepG2.2.15細胞分別消化，并用血球計數板計數，使得每孔細胞數在4000個/100 μL左右，每個樣5個復孔. 將96孔板在37 ℃恒溫、5%CO2條件下培養48 h后每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃恒溫箱反應30 min后放入酶標儀在OD450處測定吸光值，測完后放回恒溫箱繼續反應，之后每30min測定一次吸光值，共測8次.

1.7 細胞凋亡檢測

采用流式細胞儀檢測. 將未轉染重組表達載體的HepG2.2.15細胞與已轉染重組表達載體的HepG2.2.15細胞分別消化，操作步驟參考細胞凋亡分析試劑盒說明書. 用500 μL染色緩沖液重懸細胞，一個細胞樣品加入5 μLAnnexin V-PE 再加入5 μL7-AAD. 旋渦輕微震蕩數秒. 孵育30 min. 加入400 μL染色緩沖液，通過AccuriC6 flow cytometer對細胞凋亡進行檢測與分析.

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism5.0軟件進行統計學分析，實驗數據用均數±標準差(x±s)表示，多樣本均數比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 線性化pGenesil-3.1質粒載體獲得

根據pGenesil-3.1質粒載體序列，找到在其U6啟動子下存在的Hind III和BamH I酶切位點.并且這兩個酶切位點有且只有一個，所以利用限制性內切酶Hind III和BamH I進行酶切獲取線性化pGenesil-3.1質粒(圖1). 由于這兩種內切酶所用的反應液不同，所以先用Hind III進行單酶切,回收后再用BamH I進行單酶切,第二次回收產物即為線性化pGenesil-3.1質粒，見圖2～5.

圖1 pGenesil-3.1質粒載體圖譜Fig.1 Map of pGenesil-3.1 plasmid vector

M:DL15000;1：未酶切質粒；2，3：經Hind III單酶切的質粒圖2 pGenesil-3.1質粒Hind III單酶切Fig.2 The single digestion of pGenesil-3.1 plasmid Hind III

M1：DL15000；M2： DL15000；1: 回收產物；M3: DL15000圖3 質粒經Hind III單酶切后回收鑒定Fig.3 Recovered by single Hind III digestion

M1：DL2000；1：未酶切質粒；2，3：經BamH I單酶切的質粒；M2：DL15000圖4 第一次回收產物再經BamH I單酶切Fig.4 Digested with BamH I after first recovered

M1： DL15000；M2：DL15000；1:回收產物；M3:DL15000 圖5 第一次回收產物經BamH I單酶切后回收鑒定Fig.5 Identification of the first recovered product after BamH I single digestion.

2.2 重組質粒pGenesil-3.1-HBx-shRNA的表達鑒定

由pGenesil-3.1質粒圖譜及序列分析可知，有且只有在1959 bp處含有SalI酶切位點，故在插入的shRNA中,設計了一個SalI酶切位點，經SalI酶切重組載體能生成兩個條帶，其中一條約500 bp，說明重組表達載體pGenesil-3.1-HBx- shRNA構建成功，見圖6.

M1：DL2000；1：對照組；2-6：Sal I酶切；M2：DL15000圖6 重組質粒的酶切鑒定Fig.6 Identification of the digested recombinant plasmid vector

2.3 電穿孔轉染細胞后熒光顯微鏡觀察

轉染72 h后，可在轉染組細胞內看見紅色熒光，紅色熒光蛋白在細胞質及細胞核內均有表達，空白對照組內未見熒光(圖7). 利用有限稀釋法篩選陽性單克隆細胞，穩定轉染了重組表達載體的HepG2.2.15細胞已能達到60%以上. 并進行擴大培養，見圖8.

A)普通光；B)熒光 圖7 轉染72h的HepG2.2.15細胞熒光顯微鏡觀察(10×)Fig.7 Screening of HepG2.2.15 cells after 72h transfection in fluorescence microscopy (10×)

A)普通光；B)熒光 圖8 篩選轉染后的HepG2.2.15單克隆細胞熒光顯微鏡觀察(20×)Fig.8 Screening of transfected HepG2.2.15 monoclonal cells in fluorescence microscopy (20×)

2.4 HBx基因mRNA的轉錄水平

QPT-PCR檢測結果表明，單克隆培養過后，轉染組HBx基因mRNA的轉錄水平低于空白對照組. 轉染的HepG2.2.15細胞與空白組相比下降了28%(P<0.05)(圖9).

圖9 QRT-PCR檢測細胞中HBx基因mRNA的相對表達量Fig.9 Detection of relative expression of HBx mRNA in cells by QRT-PCR

2.5 CCK-8細胞增殖檢測

CCK-8細胞增殖檢測結果顯示，與空白對照組相比. 轉染組細胞增殖水平下降了47%(P<0.05)，見圖10.

圖10 CCK-8細胞增殖檢測Fig.10 CCK-8 cell proliferation assay

2.6 細胞凋亡檢測

流式細胞儀結果顯示，轉染質粒sh HBx組細胞較未轉染質粒組細胞晚期凋率增加，細胞的凋亡率也明顯增加，見圖11.

HepG2.2.15 HepG2.2.15-shRNA圖11 細胞凋亡檢測Fig.11 Detection of cells apoptosis

3 討論

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染通常導致肝硬化，肝功能衰竭和肝癌[5]. 全球約計有2.57億人患有慢性病乙型肝炎(CHB)，每年有超過88萬人死于乙型肝炎病毒(HBV)相關的并發癥如肝硬化和肝癌(HCC)(WHO報告，2017年7月)[2]. 目前，抗HBV感染的治療，主要包括α-干擾素、核苷(拉米夫定)和核苷酸(阿德福韋)類似物，但這些藥物僅在少數慢性攜帶者中產生長期反應[6]，因此，需要利用各種新技術新方法繼續尋找有效的治療方法，比如代謝組學[7]、基因組學等.

HBV具有緊湊的基因組，使其非常適合開發基于核酸雜交的抗病毒療法. 重疊的開放閱讀框(ORF)覆蓋整個病毒基因組[8]，保守區域可編碼一種以上的蛋白質以及病毒復制所需的HBV順式元件[3].HBx是多功能HBV序列的一個展示.HBx與聚合酶ORF的3′末端重疊，在病毒逆轉錄期間可以直接復制，調控轉錄重要的區域(基本核心啟動子和負調控元件)，是研究核酸雜交療法的良好靶標.

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由20～30個核苷酸互補單鏈小RNA分子引起的內源序列特異性基因沉默機制[9, 10]，具有多種可編程作用，參與幾種生物過程的調節，從而為經典治療提供了替代選擇的視角[11]. 短發卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是一條有互補發卡環的RNA序列，經常被用在RNA干擾沉默靶基因的表達中. 構建的shRNA表達載體可以與 U6 啟動子結合，以啟動shRNA的表達，并整合進入細胞基因組而被子代細胞所遺傳，使基因沉默能夠穩定實現. 細胞自身dicer酶可以切割shRNA，將其變成siRNA，隨后siRNA結合至RNA誘導的沉默復合物，使之能夠與目的mRNA進行識別和配對結合，并將其降解從而達到基因沉默的目的.

已有文獻證實HepG2.2.15細胞中有HBx蛋白的表達[12]，本實驗以HepG2.2.15細胞為研究對象，參照Patrick Arbuthnot[3]發表的研究成果，利用RNA干擾技術針對HBx的shRNA序列構建pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達載體. Sergio Carmona等[3]分析了10個有抗病毒功效的PolⅢ U6啟動子調控表達的短發夾RNA(shRNA)，發現在轉染的肝細胞中以及在可進行HBV復制的鼠流體動力學注射模型中shRNA5和shRNA6可敲低80%～100%的HBV標記物. 因此，根據HBV基因U6 shRNA5.2設計了一條可編碼HBx反義RNA的shRNA序列，為方便測量抗HBxshRNA的表達效率，插入編碼紅色熒光蛋白的基因. 通過Dicer處理較大的dsRNA可形成短干擾RNA(siRNA)雙鏈體[13]，其中一條鏈可并入RNA誘導的沉默復合物中，靶向作用于互補的細胞RNA并將其降解[14]. 因此選擇僅有單一酶切位點的Hind III和BamH I酶的質粒進行切割得到線性化pGenesil-3.1質粒，再與專門設計的HBx特異的shRNA連接，構成了完整的pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達載體. 將該質粒轉到HepG2.2.15細胞中，熒光顯微鏡觀察經克隆化達到穩定轉染具有紅色熒光的細胞數量達到60%以上，QPT-PCR檢測轉染組HBx基因水平已明顯降低，這表明pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達載體構建成功.

對轉染后的細胞進行增值活力檢測，發現較空白組細胞增殖率降低；同時細胞凋亡檢測結果表明，轉染后細胞凋亡率增加. 有文獻報道，HBx基因轉染可顯著抑制細胞凋亡，促進細胞周期從G1期進展至S期，并阻滯細胞周期進入S期[15]. 且HBx可通過激活EGFR / Akt途徑減少細胞凋亡[16].HBx的沉默可特異性地降低Dll4和裂解的Notch1的水平，同時明顯降低了Akt和Erk1 / 2的磷酸化水平，使得細胞凋亡增加和細胞周期停滯[17]. 最近的一份報告顯示，只有完整的HBx蛋白，而不是具有截短的C末端的蛋白，才能誘導細胞凋亡，這進一步表明COOH末端區域是其促凋亡功能所必需的[18]. 以上研究表明，HBx可以抑制凋亡，而本研究構建HBx沉默質粒后，細胞的凋亡率增加，這進一步證實pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達載體構建成功. 但是HBx沉默后誘導細胞凋亡增加的具體作用機制尚不明確，根據以上的研究結果，今后將對具體通路變化進一步探究.

乙型肝炎病毒HBx基因的shRNA重組表達載體pGenesil-3.1-HBx- shRNA構建成功，并且明顯降低了HepG2.2.15細胞的活性，這為進一步探究HBx對HBV的影響奠定了基礎.