茶葉花青素合成、調控及功能的研究進展

龐丹丹，張芬，張亞真，韋康，王麗鴛，成浩

中國農業科學院茶葉研究所，國家茶樹改良中心，農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

茶是世界三大無酒精飲料之一。茶葉中含有大量具有保健功能的多酚類物質，其中花青素是茶樹次生代謝途徑產生的類黃酮化合物，有助于人類抗氧化消除自由基[1]、預防心腦血管疾病[2]及癌癥[3]、降低神經退行性疾病的患病風險[4]。相關研究顯示，花青素的大量積累可導致茶樹新梢芽葉呈現紫紅色，說明茶樹花青素的生物合成與紫紅色芽葉的形成密切相關[5]。芽葉紅紫化是茶樹中較為常見的現象，紅紫色芽葉一般可分為兩種類型，一是普通茶樹品種受外界環境因素的影響，如高溫、強光等，芽葉由綠色變為紅紫色[6]；二是特異茶樹品種的新梢常年呈現紅紫色[5]，如紫娟、紫嫣等。鑒于花青素的諸多功效，茶樹花青素相關的研究顯得尤為重要。本文主要闡述了茶樹花青素的種類、生物合成、生理功能以及影響茶樹花青素生物合成的其他內外因素等，以期為茶樹花青素的開發利用提供理論基礎。

1 茶樹中花青素的種類

花青素（Anthocyanidin）屬于類黃酮化合物，是植物體內較為重要的一類次生代謝物，廣泛分布于表皮細胞的液泡中[7]，而花青素的積累能使植物呈現不同的顏色。自然狀態下，花青素主要以花色苷的形式存在，即通過形成糖苷鍵的方式與1個或多個葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等結合[8]。目前對于紫化芽葉成分的研究已開展較多，已知的花青素有20多種，“紫娟”中花青苷類主要是飛燕草-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷，其相對含量約為33%和41%[9]；“紫嫣”的花色素苷成分主要是矢車菊色素、飛燕草色素和天竺葵色素的糖苷等，約占鮮重的0.09%[10]。總體而言，茶樹紫化芽葉中花青素主要有天竺葵色素、矢車菊色素和飛燕草色素及其糖苷[11]。普通茶葉中花青素含量約占干物重的0.01%，而紫芽茶中可高達 0.5%～1.0%[12]。花青素的穩定性與所處環境的pH存在一定的聯系，研究表明在酸性條件下花青素較穩定，其他外部因素相同的條件下，盡可能低的pH可使花青素的降解減慢，從而使得其保存時間延長[13]。另外，在酸性條件下，茶葉中花白素和由兒茶素聚合形成的原花色素也能夠部分轉化為花青素。

2 茶樹花青素的生物合成與轉運

2.1 生物合成途徑

花青素的生物合成是植物類黃酮物質合成途徑的1個主要分支，茶樹中花青素生物合成途徑的主要步驟已基本探明，主要分為 3個階段（圖1）。首先，苯丙氨酸是花青素合成途徑的前體物質，在苯丙氨酸裂解酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、肉桂酸羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和 4-香豆酰 CoA連接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）作用下合成 4-香豆酰 CoA。之后，以香豆酰 CoA為底物，在查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構酶（Chalcone isomerase，CHI）和黃烷酮-3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F3H）作用下生成二氫黃酮醇。其中 CHS是編碼植物類黃酮物質生物合成途徑關鍵酶的結構基因，它通過對香豆酰CoA和丙二酰CoA分子的縮合，來催化類黃酮骨架四羥基查爾酮的形成，查爾酮的形成為許多類黃酮提供了前體物質，其中包括黃酮、黃酮醇、原花色素（縮合單寧）異黃酮和花青素；CHI催化查爾酮立體異構化為有生物學活性的相應的黃烷酮，CHI最初被認為是植物界特有的結構[14]，但最近在真菌和原核生物中也相繼被發現[15]，由于查爾酮在組織中可被 CHI快速異構化，因此，它在植物體內的大量積累是比較罕見的。F3H可催化黃烷酮C環的羥基化生成二氫黃烷酮，同時F3'H和 F3'5'H也可將黃烷酮作為底物，分別在 B環的 3'位、3'和 5'位上引入羥基。之后，DFR則可利用二氫黃酮醇，二氫楊梅素，二氫槲皮醇或二氫槲皮素其中的任何1種或全部3種作為底物，形成相應的無色花色素，為花青素生物合成提供網格結構。最終，無色花青素在花青素合成酶（ANS）和尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶（UFGT）作用下形成穩定的花色苷，隨后經過各種修飾被轉運至液泡中儲存。另外，茶樹中無色花青素可在無色花青素還原酶（LAR）的作用下形成兒茶素，花青素則可在花青素還原酶（ANR）作用下催化形成表兒茶素，繼而生成酯型兒茶素[16]。

通常花青素合成過程中會在其某些位置進行甲基化、酰基化或糖基化修飾，從而形成特異性結構。例如，在葉、花中的甲基化類黃酮含量較高[17]。在花色素中添加糖基可使相應的光譜最大值發生適度的藍移[18]。目前研究最多的糖基化是通過 UFGT/3GT添加葡萄糖基團，并已從許多植物物種中鑒定得到了UFGT/3GT酶。除了葡萄糖之外，在不同的植物中發現在5'、3'和7'位置含有鼠李糖和其他糖的花青素。除了糖基化作用之外，花青素可以通過花青素酰基轉移酶被各種有機酸酰化[19]，酰化有助于分子間堆積，以提高花青素的穩定性和水溶性[20]。

圖1 茶樹花青素生物合成途徑Fig. 1 Biosynthetic pathway of anthocyanins in tea plant

2.2 花青素的轉運

黃酮類化合物主要在植物細胞質內質網表面合成[21]，之后被轉運到不同的位置，其中花青素及原花青素被運輸到液泡中大量積累。花青素合成后的轉運過程較復雜，涉及多種轉運蛋白之間的互作。其中，谷胱甘肽轉移酶（GSTs）是植物類黃酮物質轉運過程的關鍵酶，大量研究發現，植物細胞質中GSTs可與花青素、黃酮醇等多種類黃酮化合物緊密結合[22-23]，以確保花青素在細胞質中的結構穩定性，同時便于液泡膜上轉運蛋白的識別，使其轉運至液泡中。其中GSTF是與類黃酮物質積累相關研究發現最多的家族，其可能直接作為配體蛋白，與類黃酮結合，參與花青素、原花青素的轉運[24]。

目前對于茶葉中花青素合成后轉入液泡這一問題的相關研究，相對于模式植物，茶葉中還鮮有報道。Zhao等[25]指出轉運花青素進入液泡內的多種膜蛋白，如ABC轉運蛋白、MATE轉運蛋白等都需要GST的參與。在多種植物上都發現GST基因的缺失或表達量下降會顯著減少花青素的含量，并進一步影響到植物的代謝與生長發育[26-28]。例如擬南芥tt19（屬于GST基因）同時負責花青素和無色花青素的轉運，而矮牽牛花AN9（屬于GST基因）僅負責花青素轉運。將矮牽牛花AN9基因轉入擬南芥tt19突變體，可以提高花青素的含量[26]。在茶樹中，張亞真等[29]通過對不同茶樹品種正常光照和遮陰處理下的轉錄組分析，發現CsGST24基因的表達量隨著芽葉的發育顯著下降，且與擬南芥中負責轉運花青素和原花青素的AtGSTF12基因高度相似，推測CsGST24基因可能與茶樹中花青素的轉運有關，從而造成花青素的積累。Wei等[30]對 F1群體的 6個綠色或紫色茶樹的新梢芽葉進行轉錄組分析，研究發現相對于綠芽茶樹，紫色茶樹芽葉個體中花青素轉運相關的晚期生物合成基因GST（4.6倍）、3GT（3.2倍和 2.1倍）、ANS（1.6倍）等表達量相對較高，推測茶樹中花青素的積累也可能通過激活晚期生物合成基因和花青素轉運相關基因來完成。茶樹中花青素合成后的轉運是如何進行的，GSTs在花青素累積中的可能存在的具體作用機制還需進一步的研究。

3 茶樹花青素生物合成的調控機制

花青素的生物合成受到內部和外部因素的共同調控。合成途徑中的結構基因編碼的酶確定了最終生成花青素的種類，轉錄因子則影響花青素生物合成的強度和表達模式，并且同一調節基因通常能夠控制多種不同結構基因的表達；環境因子能夠調控花青素生物合成途徑中的結構基因，同時還可調控調節基因的表達，從而影響茶樹芽葉中花青素的積累[31]。

3.1 花青素生物合成相關的調節基因

轉錄因子MYB、bHLH和WD40蛋白的復合物在多個物種中介導花青素生物合成的多個酶促步驟[32-33]，MBW復合物通過與花青素生物合成結構基因的啟動子結合，從而達到激活相關結構基因表達的功能[34]。bHLH轉錄因子（玉米R/B家族、矮牽牛AN1和JAF13蛋白）與R2R3-MYB蛋白（玉米C1、矮牽牛AN2）可激活矮牽牛和大多數其他雙子葉植物中部分花青素生物合成基因[35]。研究表明，在玉米中bHLH和R2R3-MYB相互結合有兩個作用：一是穩定蛋白質或通過兩者之間的相互作用激活轉錄，二是增強在幾個花青素生物合成基因中相對保守的順式調控元件啟動子的活性[36]。Gonzales等[33]研究發現擬南芥MYB75（PAP1），MYB90（PAP2），MYB113和 MYB114轉錄因子可調控擬南芥花青素生物合成基因F3'H，DFR，ANS和UFGT的表達，這些MYB轉錄因子是WD40和bHLH依賴性的，其中任何1種在野生型植株中過表達都可導致花青素的大量積累。在茶樹中，Wei等[30]對F1群體的6個綠色或紫色茶樹的新梢芽葉進行轉錄組分析，確定了28個差異表達的轉錄因子，其中CsMYB75基因與擬南芥中調控花青素合成的AtPAP1高度相似。Jiang等[37]運用不同的轉錄組數據庫篩選獲得至少140個R2R3-MYB轉錄因子，其中CsMYB5a和CsMYB5e過表達會強烈誘導轉基因煙草花中的花青素和原花青素生物合成結構基因的表達上調，但CsMYB5a降低了轉基因煙草中花青素的含量，促進了原花青素的積累；CsMYB5b過表達的煙草中，NtANR和NtLAR基因上調表達，且黃烷-3-醇的含量升高。He等[38]發現CsMYB6A的表達與AtMYB113最相似，并且在調控花青素合成方面一致，特異性地使得CHS和花青素3-O-葡糖糖基轉移酶基因（A3T）顯著上調表達，從而促進紫色芽葉中類黃酮物質的積累。這些結果表明，茶樹花青素合成途徑中的靶位點很可能受特定轉錄因子的調控。同時，有研究提出，MYB基因啟動子區域的甲基化能夠使得MYB轉錄因子的功能被激活或缺失[39-41]。Sun等[42]對高花青素茶樹品種紫娟的研究發現，CsAN1基因啟動子低甲基化水平導致茶樹芽葉中花青素的大量累積，初次在營養器官中報道CsAN1啟動子甲基化程度與花青素含量存在一定聯系。另外，茶樹中還存在抑制花青素合成相關的MYB轉錄因子，Li等[43]通過轉錄組和代謝分析發現，CsMYB4a基因的表達降低了CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsLAR和CsANR2基因啟動子的活性，從而抑制花青素的積累。

除了MYB和bHLH轉錄因子之外，WD40蛋白，如矮牽牛AN11，擬南芥TTG，玉米PAC1和紫蘇 WD蛋白都參與花青素生物合成復雜的調控機制[44]。但bHLH和WD40這兩種轉錄因子在茶樹花青素生物合成方面的研究較少。馬春雷等[45]利用基因芯片和文庫篩選的方式，篩選獲得2個明顯上調的調節基因MYB和WD40，推測其可能與茶葉中花青素的積累有關。趙磊等[46]從茶樹基因組中除了獲得多條編碼轉錄因子R3R3-MYB的基因外，還篩選出轉錄因子bHLH和WD40的編碼基因，通過構建進化樹發現，后兩者可能參與類黃酮物質的合成，但具體的作用機制還需進一步探索。

3.2 影響花青素生物合成的外部因素

環境因子在花青素的積累過程中起著關鍵作用[47]，茶樹花青素的生物合成受到光、溫度、氮素和蔗糖等外部因素的影響[31]，它們通過復雜的信號轉導網絡刺激轉錄因子，觸發與花青素生物合成有關的基因表達，進而造成花青素種類和含量的差異，從而影響茶樹芽葉的顏色[48]。

光可以調節花青素合成途徑中關鍵基因的表達[49]。在營養組織中，花青素生物合成的結構基因和調節基因都是受光誘導的，不同光照強度可通過影響花青素合成相關基因的表達來調控植物體內花青素的積累量。對于茶樹而言，強光能夠誘導花青素合成途徑中編碼CHS、DFR、ANS和ANR等多個關鍵酶的結構基因上調表達，使花青素的含量增加；降低光照強度，則抑制基因的表達，使得花青素的積累量減少[50]。花青素合成的調節基因CsAN1、CsGL3、CsEGL在長時間光照條件下的表達量明顯高于短光照，這表明長光照有利于MBW復合物相關基因的表達，進而促進花青素的合成[51]。

除光照強度之外，光質對植物花青素的積累也存在重要的調節作用。在蘋果、玉米中的研究表明，紫外光是影響花青素積累的主要光質成分[52]。在擬南芥中，研究發現藍光是通過隱花色素1（cry1）起作用，且cry1參與藍光誘導花青素合成基因的表達。Chatterjee等[53]將藍光調控的BnCRY1基因反義轉入歐洲油菜中，花青素的合成量明顯下降。李智等[50]研究了不同光質對茶樹花青素積累的影響，發現花青素合成途徑中的結構基因的表達量與紫外光的透射比例呈正相關，紫外光能夠上調花青素合成途徑中相關基因的表達，提高茶樹芽葉中花青素的生成量。張澤岑等[54]研究指出，除紫外光以外，紅光、藍光對于茶樹芽葉中花青素的積累的影響也較顯著，同時還提出光質對茶葉中花青素生物合成的影響可能不是孤立的。

溫度也是花青素生物合成的重要因素，低溫能夠誘導包括擬南芥和玉米在內的許多物種的花青素合成[55-56]。在茶樹中，低溫可誘導PAL、CHS、CHI等花青素生物合成相關基因的表達，使花青素含量增加；而高溫會造成基因的表達量下調，降低花青素的積累[50]。同時，溫度也會影響花青素的穩定性[57]，溫度越高花青素的降解速率越快，高溫可使酶活性降低甚至失活，合成速率減慢[49]。另外，在茶樹CsMYB5e基因過表達的煙草中，NtANS在低溫條件下顯著上調[37]，這一發現解釋了為什么在低溫生長時花青素積累。

糖作為信號物質，其信號轉導通路會調控一些基因的表達。例如，在蔗糖處理后，擬南芥中花青素生物合成途徑的相關基因顯著上調，且促進了 mRNA積累，使得花青素的含量顯著提高[58]。Weiss等[59]發現在光照條件下，只有在蔗糖和赤霉素同時存在，離體培養的矮牽牛才會著色，發現參與花青素生物合成的大多數結構基因和調節基因都受到蔗糖的調控，例如CHS、CHI、F3H、F3′H、FLS、DFR、LDOX、UFGT、MYB75和PAP1。且相對其他糖類物質，蔗糖能夠特異性地調節擬南芥中花青素生物合成的相關基因[58]。

此外，氮素缺乏也可增加植物中花青素的積累量[60-62]。低氮供應顯著增加花青素生物合成過程中PAL、CHS、F3'H、F3'5'H、ANS和DFR結構基因的轉錄水平，同時花青素合成的調節基因PAP1和PAP2的表達量也明顯上調[63-64]。在番茄中，氮缺乏引起花青素積累的這種效應是通過 MYB轉錄因子介導調節的[65]。劉健偉等[66]以高花青素的“紫娟”為材料，發現增加氮素含量能顯著抑制茶樹新梢和成熟葉中花青素合成基因的表達，這也初步證實氮素調控茶樹花青素生物合成的分子機理。

4 花青素的功能

4.1 花青素的生理功能

4.1.1 光保護作用

花青素具有 2個吸收高峰，分別位于270～290 nm紫外光區域和500～550 nm可見光區域，這也就決定了植物中所含的花青素在一定程度上會影響光合作用，因此，推測其具有吸收過濾可見光和紫外光的保護作用。大量研究表明，花青素具有緩解葉片中光氧化損傷的潛力，主要通過屏蔽葉綠體過多的高能量量子和清除活性氧物質[67-68]。Burger等[69]研究發現在受到UV-B和UV-C脅迫時，高花青素的紅葉受到的傷害顯著低于綠葉，而強可見光處理后，光抑制現象無明顯差異，這也在一定程度上證明了花青素在表皮細胞中起到了光保護的作用，但其具體的光保護機制尚不清楚。

4.1.2 滲透調節作用

花青素作為一種水溶性色素，具有滲透調節的作用。在低溫脅迫下，植物花青素合成的相關酶活性增加，促使營養器官中積累的碳水化合物轉化為花青素，表皮細胞液泡中的花青素使得葉片滲透勢降低，降低冰點以減少凍害，從而抵御逆境脅迫[70-71]。在葡萄糖和甘露醇的滲透脅迫下，植物花青素積累量增加[72]。因此，花青素可能直接或間接地參與植物細胞的滲透調節。

4.2 花青素的保健作用

茶樹紫色芽葉特異品種中富含的花青素作為一種自由基清除劑，具有抗氧化、預防心血管疾病及癌癥、改善視力等多種保健功能。費旭元等[73]對“紫娟”茶的研究表明，其茶葉中富含的花青素具有較強的抗氧化活性。林志誠等[74]指出，紫芽茶的花青素提取物作為化學抑制劑，能夠抑制結腸腫瘤細胞的增殖生長，誘導癌細胞的凋亡。國內的1項病例對照研究也顯示綠茶或烏龍茶消費量與心血管疾病患病風險呈負相關[75]。梁名志等[76]通過動物降壓試驗以及茶中相關降壓物質的分析，提出特種紫芽茶中富含的花青素可能是降壓效果顯著的重要物質。

5 展望

花青素作為一種天然色素和抗氧化劑，在醫療、保健、營養價值等方面具有廣泛的利用價值和應用前景；同時，花青素對逆境脅迫下的植物具有一定的保護作用。因此，選育特異紫色芽葉茶樹品種，開發利用高花青素新產品是目前茶樹花青素研究的重要任務。

目前，盡管轉錄組、基因功能驗證等研究為我們提供了大量基礎數據，初步了解了茶葉花青素累積的模式，且分離得到花青素生物合成途徑相關的大部分的結構基因，但花青素合成的調控基因的研究相對較為欠缺，還不足以揭示其復雜的調控機理。茶樹紫色芽葉形成的關鍵基因究竟是什么，以及外部因素如何與轉錄因子、結構基因兩者進行互作仍需要更多的證據對其加以闡述。花青素與兒茶素處于類黃酮合成途徑的不同分支，為什么在紫芽茶中較高的類黃酮合成途徑相關基因表達沒有導致兒茶素的提高而僅僅提高了花青素？在該合成途徑是否有花青素專一性的基因在起作用？對于這些問題尚沒有明確答案。此外，花青素在茶樹中的其他功能，如抗逆機制、光保護作用等相關研究也較模糊。因此，需進一步借助基因組學、轉錄組學、蛋白組學及代謝組學等技術手段，進一步挖掘關鍵的花青素合成調控的相關基因，明確其生物合成的調控機理，為茶樹富含花青素的特異品種的開發利用提供理論依據。