茶葉籽乳桿菌的分離鑒定及其發酵作用特性研究

姜金仲，楊鵬鳴，王自布，穆安德，王興春

1. 貴州師范學院，貴州 貴陽 550018；2. 貴州元亨山茶葉籽生物科技有限公司，貴州 貴陽 550018；3. 河南科技學院園藝園林學院，河南 新鄉 453003

茶葉籽油是以茶樹（Camellia sinensis）的種子為原料生產的食用油，因其含多種生物活性成分而被譽為東方橄欖油。茶葉籽油生物發酵生產工藝[1]是近年來報道的一種茶葉籽油生產新工藝。該工藝的核心技術是“茶葉籽水漿發酵分層”[2]；“茶葉籽水漿發酵分層”是指茶葉籽水漿（用茶葉籽仁加水粉碎過濾后的濾液）在適當的條件下經微生物發酵可以分為上、中、下3層；上層為茶葉籽油脂體，取出用于生產茶葉籽毛油；中層為發酵液，用于生產茶皂素；底層為淀粉，用于生產茶葉籽淀粉；因此，茶葉籽油生物發酵生產工藝可以用茶葉籽同時生產3種產品，大大提高了茶葉籽資源的利用率[3]。同時，由于是以茶葉籽油脂體為原料生產茶葉籽油，最大程度避免了茶葉籽其他構成成分對茶葉籽毛油的污染，簡化了茶葉籽毛油的精煉程序，從而提高了茶葉籽油中天然活性成分的含量，改善了茶葉籽油的營養品質。茶葉籽油生物發酵生產工藝還能使成品茶葉籽油產量比壓榨工藝提高15%～25%以上。

既然發酵分層現象是由發酵引起的，發酵液中就必然存在發酵微生物。姜金仲等[4]首先從發酵液中分離出了茶葉籽酵母，并對該酵母的發酵作用特性進行了初步研究，結果表明，茶葉籽酵母數量在發酵5 h后開始減少，10 h時已基本消失；但此時茶葉籽水漿還在繼續發酵，說明此后有其他微生物替代了茶葉籽酵母繼續發揮作用；為了證明其他微生物的存在，本文對發酵 5 h后的茶葉籽水漿發酵液進行了微生物分離鑒定，以期為優化茶葉籽油發酵工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

茶葉籽仁：由貴州元亨山茶葉籽生物科技有限公司提供，土炕烘干帶內種皮茶葉籽仁；用于生產茶葉籽仁的茶樹種子主要摘自湖北省隨州市，品種為福鼎大白茶，茶葉籽仁含水率8.4%、含油率（索氏抽提法）26.2%。

主要試劑：石油醚（德州潤昕實驗儀器有限公司）、蛋白胨及瓊脂（安琪酵母有限公司）、牛肉膏（德州潤昕實驗儀器有限公司）、酵母膏（廣州市昕迪實驗器材有限公司）、K2HPO4（佛山市順德區魏瑪化工有限公司）、NaOAc（北京迪馬歐泰科技發展中心）。主要儀器：XSP-9CA光學顯微鏡（上海光學儀器一廠）、PHSJ-4A pH計（西安禾普生物科技有限公司）、GL124-1SCN電子天平（季爾國際貿易（上海）有限公司）、TG16-WS高速離心機（濟南來寶醫療器械有限公司）、ET-7打漿機（湖北武漢宏旭機械設備責任有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉籽水漿發酵液的制備

稱取茶葉籽仁 100 g，加無菌水 300 g于35℃條件下浸泡16 h，將浸泡好的茶葉籽清洗后加無菌水300 g進行兩輪打漿、過濾得濾液（茶葉籽水漿），將濾液置于35℃恒溫發酵[2]，約5 h后，濾液開始明顯分為上、中、下3層，備用。

1.2.2 植物乳桿菌的分離純化

在茶葉籽水漿發酵進行到5 h時，從發酵液中層的中間位置取樣，在MRS固體培養基上進行劃線培養[5]，培養溫度 25℃；長出菌落后，挑選獨立的菌落，用接種針挑取樣本放在載玻片上，用甲苯胺藍染液染色[6]，觀察是否有是類似乳桿菌的細胞，如果有類似乳桿菌的細胞，則接種擴大繁殖該菌落，再進行鑒定繁殖，反復4次，得到1株類似乳桿菌的細胞純種，編號為JJZ21。

1.2.3 JJZ21菌株的鑒定

按照鑒定手冊[7]中的方法對JJZ21菌株進行形態學觀察及鑒定。包括：菌落形態及細胞形態的觀察；繁殖特性及假菌絲的觀察等；顯微鏡60倍鏡下觀察拍照。

16 S rDNA及pheS序列測定、分析及系統發育樹的構建[8]：16 S rDNA及pheS的序列測定、分析及系統發育樹繪制由中國食品發酵工業研究院微生物檢測中心完成；測序結果利用GenBank數據庫進行BLAST同源序列檢索，然后采用MEGA5.0軟件進行同源性分析，1 000次相似度重復計算，構建以置信度為依據的系統發育樹。

1.2.4 發酵液JJZ21數量動態測定

按照1.2.1的操作步驟，進行茶葉籽水漿發酵，取0～19 h（每小時1次）發酵液中層中間位置液體稀釋10 000倍，取0.2 mL稀釋液用涂布法進行MRS固體培養基接種，然后于25℃恒溫培養36 h[9]，數出每個培養基上的菌落數，重復3次。

MRS固體培養基按照文獻[10]方法配制，另外每1 000 mL培養基中添加100 μL放線菌酮溶液，121℃、20 min高壓滅菌。放線菌酮溶液的配制：準確稱取所需放線菌酮，用75%酒精配制成100 mg·mL-1的放線菌酮溶液，存放于 0～4℃冰箱中[11]。

1.2.5 茶葉籽水漿發酵液pH的測定

從發酵開始，每隔1 h取出發酵液50 mL，4 000 r·min-1離心 10 min，過濾，用 pH 計測定pH。

1.2.6 發酵液可溶性干物質含量的測定

取清潔干燥培養皿編號，稱重，用移液管吸取1.2.5濾液3 mL放于培養皿中，置于60℃烘干至恒重，重復3次，由此測算出發酵液可溶性干物質含量。

1.2.7 可溶性蛋白質及可溶性糖測定方法

取適量1.2.5中過濾后的發酵液，加水稀釋，每個時間段稀釋倍數一致。取稀釋液1 mL，放入試管中（重復 3次），加入 5 mL考馬斯亮藍溶液，充分混合，放置2 min后，測定吸光度（595 nm），按標準曲線計算蛋白質含量[12]。取稀釋液1 mL，加蒽酮試劑 5 mL，顯色后用分光光度計在 620 nm下測定可溶性糖的吸光度，按照標準曲線算出可溶性糖含量[13]，重復3次。

1.3 數據處理

試驗數據用 Excel 2003處理，并采用SSPS 17.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 JJZ21菌株的鑒定

2.1.1 JJZ21菌株的菌落及個體形態

JJZ21菌株25℃培養48 h的菌落呈圓形，白色，凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體呈桿狀（圖1），大小 (0.5～0.7) μm×(0.8～1.7) μm，單個或成對排列，革蘭氏陽性。

2.2.3 JJZ21菌株的16 S rDNA及pheS基因序列測定及分析

圖1 JJZ21菌株的個體形態Fig. 1 Individual morphology of JJZ21

JJZ21菌株的16 S rDNA序列全長為1 417 bp，pheS基因序列全長為410 bp。利用BLAST進行序列同源檢索，相似度達到98%以上的植物乳桿菌（Lactobacillus）近緣種有10種，其中與Lactobacillus plantarumssp. plantarum的相似度達到了100%。以16 S rDNA及pheS基因序列的同源性為基礎，用MEGA5.0軟件進行系統進化分析，結果得到了如圖2和圖3所示的系統發育樹。由圖2的系統發育學分析結果可以看出，該系統樹中Lactobacillus plantarumssp. plantarumATCC 14917T（ACGZ01000098）是一個單獨的外群種，JJZ21菌株與該種單獨構成一個分支；二者序列的相似性最大，遺傳距離最?。坏煽啃灾挥?6%，不足以給出結論；但由圖3可以看出，JJZ21菌株仍然與Lactobacillus plantarumssp. Plantarum相似性最大，遺傳距離最小，且可靠性達到了100%；綜合兩種分析結果，可以初步結論：JJZ21菌株與Lactobacillus plantarumssp. Plantarum的親緣關系最近。

綜合形態觀察、16 S rDNA及pheS基因序列比對、以及系統發育樹的構建與分析，中國食品發酵工業研究院微生物檢測中心將JJZ21菌株鑒定為：Lactobacillus plantarumssp. Plantarum；結合我們的研究編號，JJZ21菌株定義為：Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21；為方便以后在茶葉籽水漿發酵工藝中使用，我們將 JJZ21菌株取名為茶葉籽乳桿菌（Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21）。該菌種已于2016年9月9日保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏號為：CCTCC M 2016471。

2.2 茶葉籽乳桿菌在茶葉籽水漿發酵過程中的數量動態

為了確定茶葉籽乳桿菌（Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21）在茶葉籽水漿發酵中的作用，測定了茶葉籽水漿發酵過程中不同時段發酵液中茶葉籽乳桿菌的數量動態，檢測結果如圖4。

由圖4可以看出，發酵5 h后，發酵液茶葉籽乳桿菌數量快速增長，到 13 h時，達到最大值（每毫升149.6萬個）；發酵進行到13 h之后，菌體數量開始逐漸減小，發酵進行到22 h之后，菌體數量逐漸維持在一個穩定的水平上。

圖2 以16 S rDNA序列為基礎的植物乳桿菌系統發育樹Fig. 2 The phylogenetic tree based on 16 S rDNA

圖3 以pheS基因序列為基礎的植物乳桿菌系統發育樹Fig. 3 The phylogenetic tree based on pheS gene

茶葉籽水漿發酵分層出現在發酵 5 h左右[2]；而茶葉籽乳桿菌數量是在發酵5 h之后才開始大量繁殖的，可見茶葉籽乳桿菌對于茶葉籽水漿發酵分層現象發生的早期作用不大。雖然茶葉籽水漿發酵分層最早發生在 5 h左右，但此時的頂層非常軟散，不能進行茶葉籽油生產操作，一般要等到發酵 16 h時才是最佳操作點[3]；而茶葉籽乳桿菌是在5 h之后才進行大量繁殖的，所以，發酵進行到5 h之后，起主要發酵作用的微生物是茶葉籽乳桿菌；因此，茶葉籽乳桿菌是在茶葉籽水漿發酵中后期起主要作用的微生物。

2.4 茶葉籽乳桿菌發酵過程中發酵液可溶性干物質含量的變化

可溶性干物質質量：單位體積發酵液過濾后，60℃烘干后剩余物的質量；用 60℃烘干是為了保證烘干后的可溶性干物質不變性，便于后續的生化分析。茶葉籽水漿發酵液可溶性干物質含量隨發酵時間的變化趨勢如圖5，由圖5可以看出，可溶性干物質含量的變化分為4個階段。

0～3 h之間（茶葉籽酵母[4]為主階段）：可溶性干物質的含量隨時間的增加而增加，最高點比最低點（發酵零時）增加 37.5%；3～7 h之間（茶葉籽酵母為主階段）：可溶性干物質含量隨時間的增加快速降低，最低點（7 h）比最高點（3 h）降低了62.5%；7～16 h（茶葉籽乳桿菌為主階段）之間：可溶性干物質含量呈現震蕩緩慢走低趨勢，終點與本階段起始點相比降低了24.4%，與發酵初期最高點相比降低了71.7%；16 h以后可溶性干物質含量呈現震蕩走平趨勢，意味著可溶性物質含量不再降低，可溶性干物質的消耗基本結束。

2.5 茶葉籽乳桿菌發酵過程中發酵液生化成分及pH的變化

茶葉籽水漿發酵液可溶性蛋白質含量隨時間的變化趨勢分為兩個階段（圖6）。0～4 h，（茶葉籽酵母為主階段）可溶性蛋白質含量呈現震蕩走高趨勢，在發酵4 h時達到最高點，最高點（7.95 μg·mL-1）比起始點（7.33 μg·mL-1）提高 8.4%?？扇苄缘鞍缀咳Q于茶葉籽中可溶性蛋白溶解于發酵液中的量，溶解得越多，發酵液可溶性蛋白的含量就越高。在一定范圍之內，可溶性蛋白質在水中的溶解量會隨水溫提高而增加。茶葉籽水漿發酵液開始的溫度一般是在 20℃左右，隨著發酵時間的延長，發酵液溫度會逐漸接近設定的發酵溫度（35℃）；隨著發酵液溫度的逐漸提高，可溶性蛋白的溶解量逐漸增加，導致發酵液可溶性蛋白的含量震蕩走高，在發酵 4 h時達到最高點。4～19 h之間（茶葉籽乳桿菌為主階段）：發酵液可溶性蛋白含量呈現震蕩走低的趨勢，16 h之后，已基本穩定，此時的質量濃度（2.87 μg·mL-1）比最高點（7.95 μg·mL-1）降低了 63.9%。

圖4 不同發酵時段JJZ21菌體數量動態Fig. 4 The dynamic changes of JJZ21 number during fermentation

圖5 可溶性干物質含量隨時間的變化動態Fig. 5 The dynamic changes of soluble dry matter during fermentation

圖6 發酵液生化成分及pH隨時間的變化動態Fig. 6 The biochemical component and pH of fermented tea seed water milk during fermentation

茶葉籽水漿發酵液可溶性糖含量隨時間的變化趨勢分為震蕩走高階段和震蕩下降階段兩個階段（圖6）。0～4 h為震蕩走高階段（茶葉籽酵母為主階段），發酵液可溶性糖含量呈現震蕩走高趨勢，最高點（8.11 μg·mL-1）比最低點（7.62 μg·mL-1）增加了 6.4%，其原因與上述可溶性蛋白相似，主要是由于發酵液的溫度升高及發酵液生化指標的改變會導致可溶性糖的溶解度增加。4～19 h為震蕩下降階段（茶葉籽乳桿菌為主階段），發酵液可溶性糖含量迅速下降，最低點（19 h）比最高點（4 h）降低了60.5%。

隨著發酵時間的延長，發酵液pH逐漸降低（圖6），由開始的最高點（6.28）逐漸降低到最低點（3.39），降幅達 46.0%。其中在發酵到5～9 h時，pH在4.5左右，根據茶葉籽蛋白質等電點約為4.5的觀點[14]，此時發酵液pH正好接近茶葉籽蛋白質的等電點，意味著此時發酵液中的蛋白質溶解性降低、失去與水的親和性，為茶葉子水漿發酵分層提供了一個促成因素。

2.6 茶葉籽乳桿菌數量與發酵液其他組分動態之間的關系

茶葉籽水漿發酵分層過程是一個微生物活動的過程；隨著發酵時間的延長，發酵液干物質含量、可溶性蛋白質含量、可溶性糖含量及pH均逐漸降低，而乳桿菌的數量先增加后減少（表1）；這些降低是否與茶葉籽乳桿菌的活動有關系，可以通過相關分析得出結論，分析結果如表2。由表2可以看出，上述4種指標均與茶葉籽乳酸菌數量呈現極顯著的負相關（P＜0.01）；結合圖4的情況可以看出，發酵5 h以后，茶葉籽乳桿菌的活動是導致這些指標降低的主要因素。

表1 發酵液各種組分及pH隨發酵時間的變化Table 1 Changes of various components in fermented liquid and pH during fermentation

表2 乳桿菌數量與發酵液其他組分及pH之間的相關分析Table 2 Correlation analysis of the number of LPJJZ21 and other components and pH in fermented liquid

茶葉籽乳桿菌通過消耗發酵液中的可溶性糖及可溶性蛋白質等物質，向發酵液中分泌乳酸等酸性有機物，導致發酵液pH逐漸降低，為發酵液中的油脂體（蛋白質包裹的油脂顆粒）上浮創造了條件，進而導致茶葉籽水漿發酵分層現象發生。值得說明的是pH降低只是發酵分層現象發生的因素之一，僅僅靠pH的變化不能完成發酵分層作用。

茶葉籽中的可溶性蛋白及可溶性糖是茶葉籽毛油生產過程中美拉德反應的原料，美拉德反應的產物會導致毛油的紅色值增加[20]。茶葉籽水漿發酵液中可溶性糖及可溶性蛋白質含量大幅度降低，導致發酵法茶葉籽毛油的紅色值大幅度降低，這是發酵法茶葉籽毛油色澤較壓榨法毛油較淺的重要原因之一。

3 討論

3.1 關于茶葉籽乳桿菌

茶葉籽乳桿菌是植物乳桿菌（L.plantarumssp.plantarum）的一個菌株。植物乳桿菌由于其自身的益生特性及生物學特性，被廣泛應用于酸奶、干酪、乳酸菌飲料、干腸發酵、發酵泡菜及發酵調味品等食品中。例如：Seunggyu L等[15]對分離自泡菜中的植物乳桿菌生產酸奶的研究表明，該酸奶具有較好的抑菌功效。Erkkil? S等[16]應用植物乳桿菌發酵干腸，得到了新風味的干腸制品。周光燕等[17]將植物乳桿菌接種到泡菜中進行發酵，結果表明植物乳桿菌可明顯降低泡菜中亞硝酸鹽的含量。郭翔等[18]對植物乳桿菌作為益生菌的生物安全性做了研究，結果表明，植物乳桿菌對人體是安全無害的。綜上所述，植物乳桿菌是一個具有廣泛食品生產用途，且無毒無害的發酵微生物，因此，利用茶葉籽乳桿菌發酵生產的茶葉籽油、茶皂素及茶葉籽淀粉對人體也是安全的。值得一提的是茶葉籽水漿中含有大量的茶皂素，茶皂素具有很強的抑菌作用[19]，但是，茶葉籽乳桿菌（JJZ21）卻能在高濃度的茶皂素溶液里安全快速繁殖生長，并完成發酵作用，這是一個值得進一步研究的現象。

3.2 茶葉籽乳桿菌與茶葉籽酵母的協同作用

酵母能夠在不同程度上促進植物乳桿菌的生長[21]，在茶葉籽水漿發酵過程中，茶葉籽乳桿菌與茶葉籽酵母（Meyerozyma caribbicaJJZ11）之間也存在類似的促進關系，雙方協作完成了茶葉籽水漿的發酵作用。姜金仲認為[4]，發酵液中茶葉籽酵母細胞的數量5 h之前居最高位，5 h之后迅速下降，到10 h時基本為零。本文中茶葉籽乳桿菌從發酵5 h開始快速生長，正好接替了茶葉籽酵母數量的下降。由此可以看出，發酵初期（5 h以前），茶葉籽酵母的發酵作用為茶葉籽乳桿菌提供了適宜生長環境，茶葉籽乳桿菌才得以快速增長，從而體現了二者的協同作用。茶葉籽水漿發酵分層開始在5～7 h之間，但分層理想狀態是在16 h[2]，結合茶葉籽酵母及茶葉籽乳桿菌的數量變化動態可以看出，只有兩種微生物共同協作，才能有效完成發酵法茶葉籽油生產工藝的發酵分層。

4 結論

JJZ21菌株是從茶葉籽水漿發酵液中分離出的一種桿菌，通過分離提純、形態觀察、16 S rDNA及pheS基因測序與比對、以及系統發育樹的構建與分析，確定JJZ21為L. plantarumssp.plantarum桿菌的一個菌株；并將該菌株命名為：茶葉籽乳桿菌（L. plantarumssp.plantarumJJZ21）；菌種保藏號為CCTCC M 2016471。在茶葉籽水漿發酵過程中，發酵液中JJZ21菌體的數量5 h之后逐漸快速增加，到13 h時達到最大值，之后又逐漸降低，直至 22 h之后，又逐漸趨于穩定。茶葉籽水漿發酵過程中，茶葉籽乳桿菌需要茶葉籽酵母預先為其提供適宜的生長環境才能夠快速繁殖生長。

茶葉籽水漿發酵過程中，伴隨著茶葉籽乳桿菌數量的增加，發酵液中的干物質含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及pH均明顯下降，呈現極顯著（P＜0.01）的負相關。茶葉籽乳桿菌通過消耗發酵液中的可溶性糖及可溶性蛋白等物質，向發酵液中分泌乳酸等酸性有機物，導致發酵液pH逐漸降低，為發酵液中的油脂體上浮創造了條件，進而導致茶葉籽水漿發酵分層現象發生。發酵液可溶性糖及可溶性蛋白質含量的降低還能使發酵法茶葉籽毛油的色澤變淡。