針灸預處理對胃黏膜損傷大鼠胃黏膜微循環相關因子一氧化氮、內皮素的影響

霍新慧，智 勇，赫吉銘，郭梓杰，馮逸杰，熱愛拉·加納提

（新疆醫科大學中醫學院針灸基礎教研室，烏魯木齊 830054）

隨著人們預防觀念的逐漸加強，“治未病”成為研究的熱點，針灸預處理在中醫對胃黏膜損傷“治未病”方面療效顯著[1-2]。胃黏膜損傷（Gastric mucosal lesions，GML）常見的發病原因有物理性、化學性（如飲酒、藥物）、精神性刺激，和細菌或其毒素等因素。胃黏膜損傷的臨床表現是一系列的程序化的損傷反應，主要表現為胃黏膜充血、糜爛、水腫、壞死和脫落，以及淺表性潰瘍。針灸預處理是通過適度針灸預處理相關腧穴，以發揮其扶助正氣、激發經氣的作用，并激發一系列胃黏膜自身保護機制的作用與潛力，從而發揮其防治疾病的效應。

本研究以胃黏膜損傷指數（UI）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和內皮素（endothelin，ET）的表達為指標，探討針灸預處理對胃黏膜損傷的保護作用及與NO、ET的關系，并將針預處理和灸預處理做比較，研究二者對急性胃黏膜損傷的保護作用，并探討其對胃黏膜微循環的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠40只，3～4月齡，空腹體質量（200±50）g，雌雄各半，新疆醫科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（新）2016-0003，飼養于新疆醫科大學實驗動物中心SPF級實驗動物房，屏障來源證號：NO.65000700000749。飼養溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%，自然明暗周期，實驗期間大鼠自由飲水和進食，適應性飼養1周后進行實驗，實驗過程中動物處置方式符合動物倫理學標準。

1.2 儀器與試劑 半自動輪轉石蠟切片機（金華市科技有限公司，H3315），TG16-WS高速臺式離心機（常州市萬豐儀器制造有限公司），JJ-2組織搗碎勻漿機（常州市金壇新航儀器廠） ，lympus Bx-70 顯微成像系統（日本OLYMPUS公司）。ELISA試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

1.3 大鼠分組及處理 將大鼠編號，按隨機數字表法隨機分為4組，每組10只。1）正常組：鼠架束縛，30 min/次，1次/d，連續7 d；2）模型組：鼠架束縛，30 min/次，1次/d，連續7 d；3）針預處理組：鼠架束縛，毫針刺中脘、足三里（雙），30 min/次，1次/d，持續7 d；4）灸預處理組：鼠架束縛，溫和灸中脘、足三里（雙），30 min/次，1次/d，持續7 d。各組大鼠每次處理后松綁，回籠正常飼養，連續處理7 d，第8天大鼠禁食不禁水，第9天模型組、針預處理組和灸預處理組制作急性胃黏膜損傷模型。

1.4 腧穴定位 腧穴定位依據《實驗針灸學》[3]常用動物穴位定位法確定。中脘：臍上約20 mm，足三里：取雙后肢膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處。

1.5 針灸方法 大鼠固定于自制鼠架上，定穴后局部剪毛。毫針刺選用0.25 mm×13 mm的毫針（蘇州針灸用品有限公司），進針深度5 mm，平補平瀉法，每10 min行針1次（上午10: 00開始），1次/d，每次30 min，連續治療7 d。灸法選用溫和灸，將溫灸純艾條（南陽臥龍漢醫艾絨廠，規格4 mm×120 mm）固定于改良后的艾條懸灸支架上，使艾條點燃部位垂直距離大鼠穴位或者非穴對照點約2 cm，3個穴位同時施灸，30 min/次，1次/d，上午10: 00開始連續灸治7 d。1.6 模型制備 采用無水乙醇灌胃法[4-5]：各組大鼠在灸預處理7 d之后，禁食不禁水24 h后進行無水乙醇灌胃，正常組采用生理鹽水灌胃，按照每只大鼠0.6 mL/100 g無水乙醇劑量灌入相應劑量，為防止大鼠胃黏膜損傷后的自愈，1 h后按照2 mL/只阿司匹林混懸液進行灌胃，連續3 d。

1.7 指標檢測

1.7.1 胃黏膜損傷指數（UI） 末次給藥后，大鼠禁食24 h，禁水8 h，腹腔麻醉（10%水合氯醛0.35 mL/100 g）后立即剖腹， 所有大鼠摘下全胃，沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，將胃平攤在濾紙上，用放大鏡肉眼觀察進行UI的評定。按GUTH法[6]計算：將用冰生理鹽水沖洗干凈過的胃組織在濾紙上平展開，10倍放大鏡下用直尺肉眼觀察評估：損傷≤l mm（包括糜爛點）為1分；l mm＜損傷≤2 mm為2分；2 mm＜損傷≤3 mm為3分；3 mm＜損傷≤4 mm為4分；＞4 mm為5分；損傷寬度＞2 mm者計分加倍。每只大鼠的UI 等于胃黏膜各處糜爛的計分值的和。

1.7.2 胃組織NO、ET的測定 每組隨機抽取5只胃組織稱重，將剪碎的組織塊（0.5～1 g）放入量好的冰水中（胃組織:冰生理鹽水為1:9），用組織搗碎機10 000～15 000 r / min 研磨制成10%的胃組織勻漿，4 ℃低溫（低溫低速離心機）3 000 r/min 離心15 min，取上清液，- 20 ℃低溫保存，酶免法檢測胃黏膜組織勻漿中NO、ET的含量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行分析，實驗數據用均數±標準差（）表示。經正態性檢驗，符合正態分布者，多組計量資料比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用 LSD 和 SNK 法，若方差不齊者用Tamhane’s T2或 Dunnett’s T3法；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察 正常組大鼠胃黏膜光滑，無充血、水腫、糜爛；模型組大鼠胃黏膜明顯充血、水腫，可見不同程度的點狀、片狀和條索樣糜爛、出血點及潰瘍形成；與模型組比較，針預處理組和灸預處理組大鼠胃黏膜損傷面積明顯減少，未見潰瘍形成，可見部分點狀出血，以及條索狀糜爛；尤其是灸預處理組損傷程度最小，偶見少許點狀糜爛，無出血及潰瘍現象。

2.2 各組大鼠胃黏膜損傷指數（UI）的比較 與正常組比較，模型組、針預處理組和灸預處理組的UI指數明顯升高（P＜0.01），說明造模成功；與模型組比較，針預處理組和灸預處理組UI指數明顯降低（P＜0.01），說明針灸預處理能減輕胃黏膜損傷；與針預處理組比較，灸預處理組大鼠UI指數顯著降低（P＜0.05），說明灸預處理足三里、中脘穴，相比針預處理更能顯著減輕胃黏膜損傷。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數（UI）的比較（ ，n = 10）

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數（UI）的比較（ ，n = 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與針預處理組比較，▲P＜0.05

組 別 UI正常組 0.66±0.69模型組 13.42±4.50##針預處理組 5.91±2.70##△△灸預處理組 3.62±2.54##△△▲

2.3 各組大鼠胃組織NO、ET的比較 與正常組比較，模型組、針預處理組和灸預處理組的胃組織NO含量明顯降低（P＜0.01），ET含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，針預處理組和灸預處理組的胃組織NO含量明顯升高（P＜0.01），ET含量明顯降低（P＜0.01）；與針預處理組比較，灸預處理組大鼠的胃組織NO含量明顯升高（P＜0.05），ET含量明顯降低（P＜0.01）。說明灸預處理能顯著改善胃黏膜血液循環，抵抗胃黏膜損傷，且灸預處理比針預處理作用更顯著。

3 討論

胃黏膜損傷是導致多種消化系統疾病的主要病理生理學環節，胃黏膜受到損傷因子一定程度的侵害時，可啟動自身多層次的防御體系與修復機制[7]，即胃黏膜保護[8-9]，Wallace等人將該防御機制闡述為5個層次：粘液-碳酸氫鹽-磷脂屏障、表面上皮細胞防御體系、胃黏膜微循環屏障、胃黏膜免疫細胞屏障、胃黏膜的自身修復。

表2 各組大鼠胃組織NO、ET含量的比較（ ，n = 10）

表2 各組大鼠胃組織NO、ET含量的比較（ ，n = 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與針預處理組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 NO/（μg/g） ET/（pg/g）正常組 16.26±2.39 94.65±9.80模型組 9.17±0.68## 188.44±20.60##針預處理組 11.43±1.70##△△ 144.22±18.07##△△灸預處理組 12.85±0.64##△△▲ 113.6±13.87##△△▲▲

胃黏膜微循環屏障是一個復雜的、綜合性的調節過程，主要的調控因素有神經調節、體液調節、血管自身調節、代謝性調節、體溫調節等，血管舒張和收縮因子的失衡是其中重要因素之一。一氧化氮（nitric oxide，NO）是內源性血管舒張因子，作為一種重要的保護因子，可以有效的調節血管緊張性和內皮細胞連續性，從而擴張血管，改善胃黏膜血液循環，維持胃黏膜完整性，間接地參與調節胃的胃酸分泌，促進潰瘍愈合[10-11]。內皮素（endothelin，ET）是一種內源性損傷因子，以自分泌和旁分泌的方式作用于靶細胞上的特異性受體，ET具有強烈的收縮血管作用，在胃黏膜損傷過程中通過收縮血管和增加滲出以減少循環血量來降低胃黏膜血流，從而減弱胃黏膜防御[12-13]。

中醫根據患者臨床表現，將胃黏膜損傷歸為“胃脘痛”“嘈雜”“吐酸”“胃痞”等范疇，在治療中注重“養”而非“治”，強調“治未病”，這與現代醫學認為防治本病的關鍵點在于最大限度的激發胃黏膜自身保護機制的作用與潛力的思路不謀而合。

針灸作為中醫治未病的重要手段，在機體未病或疾病尚未發生之前，預先選取某些腧穴進行針灸刺激，以激發經氣，通過扶助正氣以防止疾病的發生，減輕疾病對機體的損害[14]。

大量的臨床研究已證實了針灸對胃黏膜的保護作用[5]，作為一種生理性溫熱刺激原，艾葉性“苦、溫、辛”，歸肝、脾、腎經，是治療胃病的外用效藥，灸預處理與針預處理和其他方法相比，在“治未病”，尤其是在預防胃黏膜損傷方面獨具優勢[1-2]。研究顯示，灸法發揮對胃黏膜損傷的防治作用，是激發機體產生內源性保護物質，并啟動一系列的保護效應：抗氧化、抗炎、抑制凋亡等抗胃黏膜損傷效應，以及損傷后胃黏膜細胞增殖、重建等[15]。

足三里是足陽明胃經的合穴、胃腑下合穴，諸多古籍記載了該穴在治療脾胃病證中具有調理脾胃、補中益氣的功效，是治療胃腑病的首選腧穴，《四總穴歌》中首句即“肚腹三里留”。現代大量臨床、機制研究的文獻也證實了足三里是治療消化系統疾病使用頻次最多的穴位，具有促進胃動力、增加胃血流量、抑制胃酸分泌，和保護胃黏膜等功效[11]。此外，足三里是全身強壯要穴之一，常用灸法以提高機體防御疾病的能力。中脘是胃之募穴，八會穴之腑會，還是手太陽、少陽、足陽明、任脈之會。本穴適當胃的中部，具有和胃健脾、疏理中氣之效。研究顯示，治療消化性潰瘍最常用的是足三里配中脘的合募配穴[16-17]，各種證型及癥狀均取此兩穴[18]，下合穴與募穴均擅于治療腑病，臨床上配伍使用可相互協調、增強療效。

本研究結果顯示，與針預處理比較，灸預處理可以明顯減輕因無水乙醇灌胃造成的急性胃黏膜損傷，上調胃黏膜組織NO、下調其ET的表達，灸預處理的效應明顯優于針預處理。提示灸預處理對胃黏膜損傷中胃黏膜微循環相關因子NO、ET有較好的調控作用，激發了胃黏膜保護機制[19-20]。