秦皮乙素降低多柔比星誘導心臟毒性的研究*

李 瀟，徐 繁，房 亮，曹向宇，姜海軍，肖 旭

（承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000）

秦皮乙素降低多柔比星誘導心臟毒性的研究*

李 瀟，徐 繁△，房 亮，曹向宇，姜海軍，肖 旭

（承德醫學院附屬醫院，河北承德 067000）

目的:探討秦皮乙素（Esc）對多柔比星（DOX）誘導的H9C2細胞損傷的保護作用及機制。方法：培養H9C2心肌細胞并分為對照組、模型（DOX）組和干預（Esc+DOX）組。流式細胞術檢測細胞凋亡情況和細胞內活性氧（ROS）的水平；蛋白印跡法檢測cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表達情況。結果：模型組H9C2細胞凋亡數量、ROS水平，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達明顯高于對照組，Bcl-2蛋白表達明顯低于對照組（P＜0.05）；干預組H9C2細胞凋亡數量、ROS水平，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05）。結論：秦皮乙素可減輕多柔比星所致的心臟毒性，其作用機制與減少細胞凋亡、降低ROS水平有關。

多柔比星；秦皮乙素；心臟毒性

多柔比星（DOX）是一種具有強抗腫瘤作用的蒽環類抗生素，主要用于治療乳腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等，但可造成嚴重的不良反應，如不可逆轉的心肌病和充血性心力衰竭。因此，多柔比星的臨床應用非常有限[1]。多柔比星誘導心臟毒性的機制比較復雜，包括刺激自由基形成增加、線粒體損傷、細胞凋亡等[2]。有研究發現，多柔比星可引起內質網應激、增加活性氧（ROS）的生成，進而導致心肌細胞凋亡[3]。秦皮乙素（Esc）是中藥秦皮的主要活性成分，具有止咳、祛痰、平喘的功效，以及抗炎、保肝、抗腫瘤等作用[4]。有研究表明，秦皮乙素可清除氧自由基、保護細胞免受過氧化物造成的損傷[5-6]。因此推測，秦皮乙素是否具有保護多柔比星所致心肌細胞損傷的作用？為此，本研究建立了多柔比星致大鼠胚胎心肌細胞（H9C2細胞）損傷模型，以探討秦皮乙素保護多柔比星致心肌細胞損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌細胞H9C2，來源于中國科學院細胞庫。RPMI-1640培養基和胎牛血清（FBS），購于HyClone Laboratories公司（美國）；Lipofectamine RNAiMAX BCA蛋白濃度測定試劑盒、AV-PI檢測試劑盒，購于Beyotime生物技術公司（中國南通）；Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bid、Bcl-2、GAPDH一抗（兔來源多抗）、二抗（羊抗兔IgG HRP抗體），購于Proteintech公司(中國武漢)；DCFH-DA，購于Invitrogen公司（美國）；多柔比星、秦皮乙素，購于阿拉丁生物化學技術有限公司（中國上海）。

1.2 細胞培養 H9C2細胞用含有10% FBS的RPMI-1640培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養，當細胞覆蓋培養瓶底部的80%時，使用胰蛋白酶消化以制備單細胞懸液。然后根據需要將細胞接種到培養板中進行分組實驗。

1.3 MTT法檢測H9C2細胞的活力 將H9C2細胞接種到96孔板，調整細胞濃度為5×104個/ml，細胞分為三組，對照組、5μM秦皮乙素組和10μM秦皮乙素組，每組設3個復孔。對照組細胞只加培養基，兩個秦皮乙素組細胞分別加入5μM、10μM秦皮乙素培養2小時；然后各組細胞加入不同濃度的多柔比星（0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM）繼續培養48小時。丟棄培養液并用PBS洗滌三次，然后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT工作溶液；4小時后，加入100μl二甲基亞楓（DMSO），振蕩10分鐘。用酶標儀在570nm處檢測吸光值（OD），并計算細胞存活率，細胞存活率(%)=（給藥組OD/空白組OD）×100%。

1.4 AV-PI雙染流式細胞術檢測H9C2細胞凋亡 將H9C2細胞接種到6孔板，調整細胞濃度為1×106個/ml。將細胞分成三組，對照組，模型組（DOX）和干預組（Esc+DOX），每組設3個復孔。對照組細胞只加入培養基；模型組細胞加入8μM多柔比星培養48小時；干預組細胞先加入10μM秦皮乙素培養2h，然后加入8μM多柔比星繼續培養48小時。培養結束后，用PBS洗滌細胞并用胰蛋白酶進行消化。將收集的細胞重懸于0.3ml結合緩沖液中，加入5μl AV和5μl PI室溫下避光孵育15分鐘，然后加入0.2ml結合緩沖液，使用流式細胞儀檢測每組細胞的凋亡情況。

1.5 流式細胞儀檢測H9C2細胞ROS水平 H9C2細胞分組和處置方法同1.4。培養結束后，在細胞中加入10μM DCFH-DA染色溶液，37℃避光孵育20分鐘，采用流式細胞儀檢測各組細胞ROS的水平。

1.6 蛋白印跡法檢測H9C2細胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表達 H9C2細胞分組和處置方法同1.4。培養后收集細胞，RIPA細胞裂解液裂解細胞，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕式轉膜將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，分別加入cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid、Bcl-2、GAPDH一抗（1：1000）4℃孵育過夜，二抗（1：2000稀釋）室溫下孵育2h，ECL超敏發光液顯影并攝片。以目的條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計分析 使用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，所有實驗數據均以均數±標準差表示，三組計量資料的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 H9C2細胞的存活率 MTT結果顯示，隨著多柔比星濃度的增加，對照組H9C2細胞存活率逐漸下降，呈濃度依賴性（P＜0.05）。與對照組細胞相比，5μM和10μM的秦皮乙素預處理H9C2細胞2小時，H9C2細胞的存活率明顯升高（P＜0.01）；并且，10μM秦皮乙素的效果優于5μM秦皮乙素（P＜0.05）。附圖A。

2.2 H9C2細胞的凋亡情況和ROS的水平 模型組H9C2細胞凋亡數量、ROS水平明顯高于對照組，干預組H9C2細胞凋亡數量和ROS水平明顯低于模型組（P＜0.05）。見附圖B，附表：

附表 H9C2細胞ROS水平和相關蛋白的表達情況（±s ,n=3）

附表 H9C2細胞ROS水平和相關蛋白的表達情況（±s ,n=3）

與模型組比較：**P＜0.01

組別ROS水平cleaved Caspase-3cleaved PARPBidBcl-2對照組93.46±4.11**0.235±0.057**0.197±0.019**0.507±0.101**0.674±0.054**模型組189.71±7.631.492±0.1710.526±0.0610.232±0.1100.241±0.073干預組118.13±9.56**0.218±0.057**0.223±0.027**0.452±0.051**0.662±0.028**

2.3 H9C2細胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表達情況 模型組H9C2細胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達明顯高于對照組，Bcl-2蛋白表達明顯低于對照組（P＜0.05）；干預組H9C2細胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05）。見附圖C-D，附表。

附圖 各指標檢測結果

3 討論

多柔比星（DOX）是一種廣泛用于惡性腫瘤化療的蒽環類藥物，治療腫瘤效果顯著，但多柔比星具有明顯的心臟毒性，嚴重制約了其在臨床上的應用，盡可能減輕化療時多柔比星的心臟毒性一直是臨床醫師關注的問題。

多柔比星誘導心臟毒性的機制比較復雜，包括細胞內活性氧生成增加、線粒體功能紊亂、DNA損傷、細胞凋亡等[7]。本研究亦證實了上述研究結果，加入多柔比星的模型組H9C2細胞凋亡數量和ROS水平明顯高于對照組；同時，本研究發現，模型組H9C2細胞與凋亡相關的蛋白，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid表達明顯升高，Bcl-2表達明顯降低。現已證明，細胞凋亡包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑等三條。Caspase-3是凋亡過程中最關鍵的蛋白酶，是多種死亡受體介導的凋亡途徑的共同下游效應部分。Caspase-3活化后，可酶解、切割特異性底物，如DNA依賴性蛋白激酶、固醇調控元件結合蛋白等，通過改變其結構或影響特定信號分子引起細胞凋亡[8]。cleaved PARP是凋亡細胞中活化的Caspase-3的水解產物，是細胞凋亡的標志。Bid和Bcl-2是Bcl-2家族中具有代表性的成員，Bid蛋白具有促進細胞凋亡的作用，Bcl-2可抑制細胞凋亡[9]。

本研究結果顯示，加入秦皮乙素的干預組H9C2細胞，凋亡數量明顯減少，ROS水平及cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高。本研究提示，秦皮乙素可通過調節cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid、Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達減少細胞凋亡，以及通過減少活性氧的產生，減輕多柔比星對心肌細胞的毒性。本研究可為相關臨床研究提供實驗依據，但秦皮乙素減輕多柔比星致心臟毒性的其他機制尚需深入探討。

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STUDY ON ESCULETIN REDUCE CARDIOTOXICITY INDUCED BY DOXORUBICIN

LI Xiao, XU Fan, FANG Liang, et al

(the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the protective effects and mechanisms of esculetin (Esc) on H9C2 cells injury induced by doxorubicin (DOX).Methods:The H9C2 cells were cultured and divided into control group, model(DOX) group and intervention (Esc+DOX) group. Flow cytometry was used to detect apoptosis of H9C2 cells and reactive oxygen (ROS) level in H9C2 cells; Western blotting to detect the cleaved Caspase-3, cleaved PARP, Bid and Bcl-2 protein expression in H9C2 cells.Results:The number of apoptosis, ROS level, cleaved Caspase-3, cleaved PARP and Bid protein expression in H9C2 cells in model group were obviously higher than control group; the Bcl-2 protein expression were obviously lower (P<0.05). The number of apoptosis, ROS level, cleaved Caspase-3, cleaved PARP and Bid protein expression in H9C2 cells in intervention group were obviously lower than model group; the Bcl-2 protein expression were obviously higher (P<0.05).Conclusions:Esculetin can reduce cardiotoxicity induced by doxorubicin by reducing apoptosis and ROS level.

Doxorubicin; Esculetin; Cardiotoxicity

R453.9

A

1004-6879（2018）01-0011-04

* 河北省2017年度醫學科學研究重點課題計劃（20170886）

△ 通訊作者

2017-04-04）

(基礎醫學欄目編輯：陳志宏)