低溫條件下即食蝦中單增李斯特菌與副溶血性弧菌共存分子預測模型的建立

牛 犇，穆麗麗，張昭寰，劉海泉,2,3,4，潘迎捷,2,3，趙 勇,2,3,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；4.上海海洋大學食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于各種食品基質之中，尤其在低溫下具很強的生長能力[1]，可引起人畜共患的疾病，致死率高達20%～70%[2]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水產品中常見的病原菌，在夏季其污染率高達90%[3-4]，誤食被該菌感染的水產品易導致敗血癥和腸胃炎等疾病的發生[5]。研究表明，這兩種食源性致病菌常共存于同一食品體系中[6]，加工、貯運和銷售過程中的不規范操作都能增加其交叉感染的概率[7-8]，從而導致極大的食品安全隱患。預測微生物模型是一種重要的工具，可用于描述特定狀況下微生物的生長、死亡及存活情況，廣泛應用于食源性致病菌患病風險的評估及控制。傳統的預測微生物學模型基于微生物培養的方法，具有靈敏度低、耗時長、操作繁瑣等缺陷，而且往往只局限于單一微生物存在的生長失活情況，明顯不符合實際情況。隨著科學技術的發展，研究人員將先進的實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、DNA探針法、宏基因組學測序技術等分子生物學技術應用于預測微生物學研究[9]，構建了新型的“分子預測模型”，該模型具有極高的特異性，可同時描述多株致病菌并存狀態下的生長趨勢，有效地彌補了傳統預測微生物模型的不足。

現階段，關于單增李斯特菌和副溶血性弧菌的傳統預測模型的研究已相對比較成熟[10-12]，也有部分學者構建了單增李斯特菌和副溶血性弧菌各自的分子預測模型[5,13-16]。但是，關于單增李斯特菌與副溶血性弧菌混合共存于同一環境下的研究還鮮有報道。因此，本研究運用qPCR技術，模擬超市、冷鏈的溫度環境（4 ℃和10 ℃），監測即食蝦中單增生李斯特菌與副溶血性弧菌共存時菌量的動態變化，旨在描述低溫環境下單增生李斯特菌與副溶血性弧菌在即食蝦中的命運變化，建立混合致病菌共存的分子預測模型，為有效控制這兩種食源性致病菌提供可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對蝦購自上海浦東新區古棕路農工商超市，于-80 ℃保存；qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成（單增李斯特菌：hlyA-F：5’-ACTTCGGCGCAATCAGTGA-3’，hlyA-R：5’-TTGCA ACTGCTCTTTAGTAACAGCTT-3’[17]；副溶血性弧菌：tlh-F：5’-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3’，tlh-R：5’-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3’）[18]。

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，TCBS）培養基、PALCAM瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基 北京陸橋技術有限責任公司；2×SYBR Green Master Mix 瑞士羅氏公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

離心機 德國Eppendorf公司；BagMixer 400VW型拍打式均質器 法國Interscience公司；高精度恒溫培養箱 日本Sanyan公司；7500fast qPCR儀 美國ABI公司；多功能酶標儀美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取-80 ℃保存的單增李斯特菌ATCC19115與副溶血性弧菌ATCC33847菌種，分別劃線接種于PALCAM瓊脂培養基和TCBS培養基中，37 ℃過夜培養24 h，選取特異性的單菌落，分別接種于9 mL TSB和9 mL TSB培養基（含質量分數3% NaCl溶液）中，于37 ℃、200 r/min搖床培養16 h后獲得成熟的細菌培養液。

1.3.2 蝦樣品準備及DNA提取

南美白對蝦樣品于4 ℃下解凍，通過加熱含質量分數2.5% NaCl的去離子水（100 ℃、20 min）進行背景微生物去除，置于生物安全柜中冷卻至室溫。取單增李斯特菌與副溶血性弧菌培養液于離心管中，3 000×g、25 ℃離心10 min，去除上清液，在磷酸鹽緩沖液中進行重懸，得到最終菌量為108CFU/mL的菌懸液。將菌液以質量比1∶1進行混合，接種于南美白對蝦之中，使得每只蝦樣品中致病菌的數量為105～106CFU/g。人工接種后的樣品置于4 ℃及10 ℃恒溫培養箱中培養。定時從培養箱中隨機取出樣品，于90 mL生理鹽水中使用均質機拍打2 min，吸取2 mL均質液，200×g、4 ℃離心1 min，取上清液1 mL于1.5 mL離心管中，12 000 r/min、4 ℃離心2 min，棄去上清液，制得菌體，按照試劑盒說明書提取DNA，于-80 ℃保存備用。

1.3.3 qPCR測定

qPCR體系為20 μL：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，引物F 1.5 μL（10 μmol/μL），引物R 1.5 μL（10 μmol/μL），DNA模板2 μL及ddH2O 5 μL。程序為：50 ℃、2 min；95 ℃、10 min；95 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，40 個循環。

1.3.4 標準曲線建立

取1.3.2節最終菌量為108CFU/mL的單增李斯特菌與副溶血性弧菌菌懸液進行梯度稀釋，獲得最終菌量為101～108CFU/mL的稀釋液，按照1.3.2節和1.3.3節方法分別進行DNA抽提和qPCR，輸出相應的循環閾值（Ct值）作為標準曲線Y軸。將不同菌量的稀釋液涂布于PALCAM瓊脂及TCBS培養基上，計數結果作為X軸，構建該反應的標準曲線，并計算曲線的斜率（K），利用公式（1）計算反應的擴增效率E。

1.3.5 模型的建立

運用Origin 8.0軟件對實驗結果進行處理，選用生長模型（修正Gompertz、Logistic、Baranyi）和失活模型（Log-linear、Weibull）分別擬合兩株菌的生長或失活趨勢[19-22]。

1.3.5.1 修正Gompertz模型

修正Gompertz模型的數學表達式如式（2）、（3）所示。

式中：Yt為t時的細胞數（lg（CFU/g））；Y0與Ymax為擬合的初始數量和最大數量（lg（CFU/g））；tmax為達到相對最大生長速率的時間/h；μmax為tmax時的最大比生長速率/（（lg（CFU/g））/d）；λ為延滯期/d。

1.3.5.2 Logistic模型

Logistic模型的數學表達式如式（4）所示。

1.3.5.3 Baranyi模型

Baranyi模型的數學表達式如式（5）～（7）所示。

1.3.5.4 Log-linear模型

Log-linear模型的數學表達式如式（8）所示。

式中：K是最大比失活率/（（lg（CFU/g））/d）。

1.3.5.5 Weibull模型

Weibull模型的數學表達式如式（9）所示。

式中：b是速率參數；n是擬合參數。

1.3.6 模型的評價

運用決定系數（R2）、均方根誤差（the root mean square error，RMSE）、準確因子（accuracy factors，Af）和偏差因子（bias factors，Bf）評價模型的擬合效果，公式分別如式（10）～（13）所示[11]。

1.4 數據處理

運用Origin 2017軟件對兩組數據進行擬合，建立標準曲線，采用生長模型（修正Gompertz、Logistic、Baranyi）和失活模型（Log-linear、Weibull）分別擬合兩株菌的生長或失活趨勢。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立結果

單增李斯特菌的標準曲線為：y＝-3.27x+46.66（R2＝0.974，E＝102.2%）（圖1A），副溶血性弧菌的標準曲線為：y＝-3.49x+44.61（R2＝0.980，E＝93.4%）（圖1B），擴增效率均在可接受的范圍內（80%～120%）[23]，所建立的標準曲線可適用于后續監測即食蝦中單增生李斯特菌與副溶血性弧菌共存時的菌量變化。

圖1 單增李斯特菌（A）與副溶血性弧菌（B）標準曲線的構建Fig.1 Standard curves for quantification of L. monocytogenes (A)and V. parahaemolyticus (B)

2.2 生長模型的建立結果

通過Origin 8.0軟件對qPCR數據進行模型擬合，獲得4 ℃和10 ℃條件下即食蝦中單增李斯特菌的生長曲線（圖2）和生長動力學參數（表1）。在4 ℃和10 ℃條件下，單增李斯特菌均呈S型生長趨勢，對比于4 ℃條件，10 ℃時單增李斯特菌的延滯期更短，最大比生長速率更大。

圖2 即食蝦中單增李斯特菌生長曲線擬合結果Fig.2 Growth curves of L. monocytogenes on cooked shrimps

表1 不同生長動力學模型下即食蝦中單增李斯特菌的生長參數Table1 Growth kinetic parameters of L. monocytogenes on cooked shrimps

本研究運用R2、Af和Bf評價模型的擬合效果。R2用于描述預測值和觀測值的相關程度[24]，R2越趨近于1，表明預測模型參考價值越高；R2越趨近于0，則表明其參考價值越低[25]。Af能反映觀測值與預測值間的接近程度：若Af＝1，則表明所有觀測值與預測值均相等，可視為完美模型[26]；Af越大，則其平均精確度越低；Af一般用來驗證預測模型的準確度，衡量模型預測的平均精確[27]。Bf一般作為判斷預測模型偏差度的參數，表明了所建預測模型的結構性偏差，用于評價預測值偏離等值線的程度，且可判斷預測值在等值線的上方還是下方。對于微生物代時（generation time，GT），如果Bf＜1，說明該模型是失效保護模型，即GT平均預測值比觀測值要小，這樣預測模型可以給出一個安全的預測界限；Bf若在0.90～1.05之間，則說明擬合效果較好，使用該模型具有較小的偏差[28]；Bf在0.70～0.90或1.06～1.15的范圍內是可接受的；Bf＜0.70或Bf＞1.15則為不可接受，說明模型偏差較大、不可信[27]。

表2 修正Gompertz、Logistic、Baranyi、Log-linear和Weibull模型的R2、RMSE、Af和BfTable2 R2, RMSE, Af and Bf values of modified Gompertz, Logistic,Baranyi, Log-linear and Weibull models

由表2可知，Baranyi、修正Gompertz和Logistic模型R2均在0.98以上，各自的Af和Bf都非常接近1，表明這3 種模型都能較好地描述不同低溫下即食蝦中單增李斯特菌的生長狀況，qPCR技術能夠應用于混菌條件下單增李斯特菌生長趨勢的描述。

2.3 失活模型的建立結果

圖3 即食蝦中副溶血性弧菌失活曲線擬合結果Fig.3 Inactivation curves of V. parahaemolyticus on cooked shrimps

表3 不同失活模型下即食蝦中副溶血性弧菌失活參數Table3 Inactivation kinetic parameters of V. parahaemolyticus on cooked shrimps

如圖3、表3所示，4 ℃條件下Weibull模型（Yt＝4.397-0.121×t1.176）與Log-linear模型（Yt＝4.455-0.176×t）的R2分別是0.950和0.945（表2），各自的Af都接近1，Bf大于1且在可接受范圍內（1.06～1.15），表明擬合效果較好。然而在10 ℃條件下，副溶血性弧菌的失活模型R2僅為0.784和0.775，這表明在10 ℃條件下，Weibull與Log-linear模型對副溶血性弧菌失擬，qPCR技術難以用于描述混菌條件下副溶血性弧菌的失活趨勢。

3 討 論

本研究運用qPCR技術建立了低溫下（4 ℃和10 ℃）單增李斯特菌與副溶血性弧菌共存于即食蝦中的混合生長模型，對于單增李斯特菌，3 種模型的R2均在0.98以上，表明3 種模型均可以較好地描繪即食蝦中單增李斯特菌的生長情況。qPCR具有特異性強、快速、高效等優勢，且能夠提供傳統培養方法無法量化的信息，雖然不能完全替代傳統方法，但彌補了傳統預測微生物模型的不足[9,29-30]。

在利用qPCR所建立的副溶血性弧菌在4 ℃和10 ℃的失活模型中，Log-linear模型和Weibull模型的R2在4 ℃時分別為0.950和0.945，所得副溶血性弧菌的生長曲線呈急劇下降趨勢，比單株副溶血性弧菌在4 ℃生長條件下失活更嚴重[5]。表明混菌狀態下副溶血性弧菌的失活不僅與環境因子（溫度）有關，還可能受到單增李斯特菌影響。而在10 ℃條件下，Log-linear模型和Weibull模型的R2分別為0.775和0.784，所得副溶血性弧菌生長曲線呈下降趨勢，這與孫文爍[5]與黃和[31]等的報道稍有不同。在10 ℃條件下，孫文爍等的研究表明由平板涂布所得到的副溶血性弧菌的生長曲線呈現先下降后上升的趨勢，且生長曲線不符合任何一級生長模型[5]。而黃和等也利用qPCR方法，得到的生長曲線則呈現緩慢上升的趨勢，說明在10 ℃條件下qPCR很可能更適合揭示微生物的生長情況[5,31]。而本研究中模型失擬，且其生長呈失活趨勢。混菌狀態下建立的微生物預測模型更貼近真實情況，能更準確地反映微生物在真實環境中生長的實際規律。

本研究建立了基于混菌環境下的分子預測模型，描述低溫下共存于即食蝦中的副溶血性弧菌和單增李斯特菌的生長失活情況。為利用分子預測模型作為工具研究混菌環境下共存微生物的生長失活提供了依據，為微生物風險評估研究的逐步深入及完善提供理論技術支持，可以進一步揭示實際樣品中微生物的生長狀況，為微生物風險評估過程中可能忽視的潛在風險提供更加全面的信息。