李學鵬,劉慈坤,范大明,王金廂,儀淑敏,勵建榮,*,李婷婷,李鈺金,牟偉麗,沈 琳,黃建聯
(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧 錦州 121013;2.江南大學食品學院,江蘇 無錫 214122;3.大連民族大學生命科學學院,遼寧 大連 116600;4.榮成泰祥食品股份有限公司,山東 榮成 264300;5.蓬萊京魯漁業有限公司,山東 煙臺 265600;6.大連東霖食品股份有限公司,遼寧 大連 116007;7.遼寧安井食品有限公司,遼寧 鞍山 361003)
近年來,我國水產品加工行業趨向于多元化發展,已形成了冷凍調理制品、魚糜制品、干制品、腌熏制品、罐頭制品、調味品、休閑食品等加工食品體系。伴隨水產品加工業的快速發展而產生的下腳料問題成為困擾行業的一大難題,下腳料的高值化利用及生物轉化已成為企業未來競爭力的關鍵[1]。鰈魚是我國主要的海水養殖和加工品種,2016年鰈魚養殖產量達到了13 380 t,是所有海水魚中養殖增量最大的魚種,比2015年增加了55.26%[2]。鰈魚骨是凍鰈魚片加工過程中產生的主要下腳料,產量很大。由于缺乏相應的精深加工技術,魚骨等下腳料常被丟棄或者低價賣給魚粉廠,簡單做成魚粉、肥料和飼料等低附加值產品,不僅造成了嚴重的資源浪費和環境污染,同時也大大影響了企業效益。開發經濟、實用的魚骨加工技術及產品成為眾多水產加工企業的迫切需求。
魚骨中含有大量鈣質,目前對魚骨的加工利用研究主要集中在通過酶解、螯合工藝制備膠原多肽螯合鈣[3];通過堿醇法制備成鈣片[4];采用高壓蒸煮、酶解、復配等工藝開發魚骨膏體調味料、魚骨酥、魚骨粉等產品[5]。而利用超微粉碎技術將魚骨制成超微細魚骨泥,并將其添加到魚糜制品中開發高鈣魚糜制品的研究仍鮮見報道,尤其是添加魚骨泥對魚糜凝膠品質影響的研究尚不多見[6]。魚糜制品是一類低脂肪、高蛋白、低膽固醇的營養健康食品,深受消費者喜愛,近年來發展迅速、需求量快速增長,在世界各國都有著廣闊的市場。將魚骨泥與魚糜制品結合開發高鈣系列魚糜制品,不僅能提高魚骨的利用率和附加值,同時可豐富魚糜制品品種。本實驗通過研究添加微細魚骨泥對魚糜制品凝膠強度、質構、色澤、微觀結構等品質的影響,為高鈣魚糜制品的開發和魚骨高值化利用提供依據和支撐。
鰈魚骨 大連天寶綠色食品股份有限公司;金線魚魚糜 青島錦燦食品有限公司。
磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、五水硫酸銅、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;蛋白分子質量Marker 大連寶生生物工程公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)所用試劑 上海生物工程有限公司。
RRH-A250型高速萬能粉碎機 上海緣沃工貿有限公司;JMS-50型膠體磨 河北廊坊祥通機械有限公司;QDGX型高精密濕法超微粉碎機 無錫輕大食品裝備有限公司;SQ2119B型多功能食品加工機 上海帥佳電子科技有限公司;DELTA 320型pH計、PL602-L型電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH.6型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;UV-2100型紫外-可見分光光度計 日本島津公司;Milli.Q型超純水機密理博中國有限公司;Forma 702型-80 ℃超低溫冰箱、Biofuge Stratos臺式高速離心機 美國Thermo Fisher公司;T25 basic型高速分散均質機 德國IKA公司;3CELL型Mini Tetra電泳槽 美國Bio-Rad公司;CR-400型色彩色差計、S4800場發射掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM) 日本KONICA MINOLTA公司;TA.XT plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司。
1.3.1 制備微細骨泥的工藝流程
鰈魚骨→清洗、切塊→冷凍→粗粉碎(萬能粉碎機)→強力骨泥機→細粉碎(膠體磨)→濕法超微粉碎(高精密濕法超微粉碎機)→離心脫水→微細骨泥。
骨泥粒徑采用流水過篩法進行測定。由于骨泥中含有魚肉,易吸水膨脹,因此在過篩前取一定量的骨泥用質量分數5% SDS溶液攪拌1 h后5 000 r/min離心10 min,取下層沉淀,將其置于相應的泰勒篩上用流水沖洗,當物料通過率大于95%時即判定為骨泥粒徑。本實驗用骨泥粒徑為100 目。
1.3.2 魚糜凝膠的制備
取500 g冷凍魚糜室溫下半解凍后切塊,置于斬拌機斬拌2 min,再加入質量分數2%食鹽擂潰3 min,最后分別加入質量分數為2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%骨泥(本實驗中添加骨泥質量分數均以冷凍魚糜的質量為基準)并調節水分質量分數為80%,繼續斬拌2 min;整個過程溫度嚴格控制在10 ℃以下。斬拌結束后將物料填至25 mm的腸衣中成型,灌腸后采用二段式加熱法(40 ℃、30 min,90 ℃、5 min)進行凝膠化和熟化定型,加熱結束后取出置于冰水中冷卻10 min,放入4 ℃冰箱靜置過夜,待測。
1.3.3 魚糜溶膠pH值測定
取1.3.2節經斬拌的魚糜溶膠,參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[7]方法進行pH值測定。
1.3.4 溶膠中肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活力測定
參考陸海霞[8]、Riebory[9]等方法略作修改,測定魚糜溶膠中肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活力。具體方法如下:魚糜溶膠與Tris-HCl緩沖液(0.6 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl,pH 7)以1:10(m/m)充分勻漿,于4 ℃下浸提1 h,然后在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min,所得上清液為肌原纖維蛋白溶液。采用雙縮脲法在波長540 nm處測定吸光度,并換算為蛋白質量濃度。
取0.5 mL肌原纖維蛋白溶液(質量濃度為3.0 mg/mL),與0.25 mL 20 mmol/L ATP溶液、0.25 mL 0.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH 7)、0.5 mL 1 mol/L KCl溶液、3.5 mL去離子水混合,在25 ℃反應10 min,加入1.0 mL質量分數10%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)終止反應,空白溶液在加入ATP溶液前加入TCA。采用3 500×g離心5 min去除沉淀,取2.0 mL上清液加入8 mL顯色液,于25 mL容量瓶定容。采用鉬藍比色法測定反應中釋放的無機磷含量。
1.3.5 凝膠強度的測定
將凝膠切成25 mm×20 mm(直徑×高度)的圓柱體,用TA.XT plus質構儀的球形探頭P/0.5S進行穿刺實驗,下壓速率設定為1 mm/s,下壓高度為10 mm,下壓力為5 g。破斷力定義為穿刺曲線上出現的第一個峰;凹陷深度定義為與破斷強度相對應的破斷距離;凝膠強度定義為破斷強度與凹陷深度的乘積。
1.3.6 凝膠質構的測定
樣品前處理同1.3.5節方法,使用的探頭更換為P/50柱形探頭。測定參數:測試速率恒定為1 mm/s,壓縮形變為30%,下壓力為5 g,得到樣品的硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性等指標。
1.3.7 凝膠色澤的測定
采用CR-400色彩色差計對樣品的色澤進行測定,將樣品切成25 mm×20 mm的圓柱形塊,儀器用標準白板、黑板分別校正后,在室溫下分別測定樣品的上、下、左、右、中5 個區域,得到凝膠樣品的L*、a*、b*值,其中L*值表示亮度,a*值表示紅綠色,b*值表示黃藍色,通過公式(1)計算白度值。

1.3.8 凝膠持水性的測定
采用高速離心法測定凝膠的持水性。將樣品切成10 mm×10 mm小塊稱質量,計為m;用兩層濾紙包裹樣品塊,置于50 mL離心管中,10 000 r/min離心10 min后取出,質量記為m1。持水性按公式(2)計算。

1.3.9 凝膠溶解度的測定
參照Benjakul等[10]的方法略作修改。稱取魚糜凝膠1 g,切碎后加入20 mL 0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液(含8 mol/L尿素、10 g/L SDS、體積分數2% β-巰基乙醇,pH 8.0),用高速分散器勻漿4 min,沸水浴2 min,冷卻至室溫后攪拌30 min,在10 000 r/min條件下離心10 min。吸取上清液10 mL并添加2.5 mL 0.5 g/mL TCA,在4 ℃條件下靜置18 h,在10 000 r/min離心30 min,沉淀物用3 倍體積0.1 g/mL TCA冷溶液洗滌,待沉淀干燥后溶解于30 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中。魚糜凝膠直接溶解于30 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中,采用雙縮脲法測定蛋白質量濃度,測得的蛋白質量濃度為總蛋白質量濃度,溶解于混合劑中的蛋白質量濃度與總蛋白質量濃度的比值即為凝膠溶解度。
1.3.10 SDS-PAGE分析
參考Laemmli[11]和Xiong Youling L.[12]等的方法。稱取魚糜凝膠1 g,切碎后加入9 mL 5% SDS溶液,用高速分散均質機均質2 min,均勻混合后85 ℃水浴加熱1 h使蛋白質充分溶出,冷卻后將勻漿液在10 000 r/min條件下離心10 min,取上清液與樣品緩沖液以體積比1∶1混合,沸水浴5 min。制膠后上樣10 μL,其中濃縮膠質量分數為4%,分離膠質量分數為12%,在100 V恒壓下進行實驗。電泳完成后用質量分數0.1%考馬斯亮藍染色5~10 min,脫色至背景基本無色,使用Quantity One軟件進行分析和處理。
1.3.11 凝膠SEM觀察
將待測魚糜凝膠切成小塊,浸泡在體積分數2.5%戊二醛溶液中,在4 ℃下固定24 h,再用0.1 mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液漂洗數次,然后用體積分數50%、70%、90%、100%乙醇溶液逐級脫水各10 min。使用冷凍干燥機干燥,經真空離子濺射儀噴金后,用SEM觀察結構。
采用SPSS 19.0和Origin 8.5軟件對數據進行方差分析、顯著性檢驗、相關性分析和因子分析,多重比較采用Duncan檢驗,P<0.05表示差異或相關性顯著。
研究表明,pH值是肌原纖維蛋白凝膠的重要影響因素,其影響途徑主要有兩方面:1)pH值對肌原纖維蛋白二級結構具有顯著的影響。當pH值逐漸由肌原纖維蛋白等電點(約5.0~5.2)向中性范圍接近時,蛋白質天然二級結構中α-螺旋的含量也越多,凝膠的微觀結構、保水性及凝膠強度與其變化保持一致[13-14],但是β-折疊的含量呈現降低的趨勢。2)pH值會直接影響到肌球蛋白ATP酶的活力。當pH值過低時,肌球蛋白ATP酶的某些活性基團發生不可逆轉變化,影響肌球蛋白與肌動蛋白之間的結合能力,從而影響肉制品的凝膠強度[15-16]。另外,研究表明魚糜凝膠制品的最適pH值為6.5~7.5之間的中性區域[17]。從圖1可以看出,隨著骨泥質量分數的增加,魚糜溶膠pH值略有上升,可能與Ca2+含量增加和骨泥本身pH值有關,但均保持在pH6.8~7.0范圍之間,能夠滿足魚糜凝膠制品的適宜加工條件,說明魚骨泥的添加不影響魚糜凝膠形成的基本條件。

圖1 骨泥質量分數對魚糜溶膠pH值的影響Fig.1 Effect of fish bone paste addition on pH of surimi sol

圖2 骨泥質量分數對魚糜溶膠中肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活力的影響Fig.2 Effect of fish bone paste addition on Ca2+-ATPase activity of myofibril protein in surimi sol
ATP酶活力是肌球蛋白的最重要特性之一。肌球蛋白中的ATP酶可以分解ATP釋放能量,并牽引與之相連的肌動蛋白產生一定的位移。魚糜在加熱處理后,肌球蛋白與肌動蛋白結合形成凝膠[18]。添加適量的Ca2+可以保持肌球蛋白ATP酶的穩定性并提高其活力,從而使其與肌動蛋白結合,形成致密、有序的三維網狀結構。由圖2可知,Ca2+-ATP酶活力隨著骨泥質量分數的增加呈現先增加后降低的趨勢(P<0.05)。當骨泥質量分數為5.0%時,相應的Ca2+-ATP酶活力達到最高值0.481 μmol/(min·mg),與對照組相比提高了7.9 倍。而隨著骨泥的進一步添加,Ca2+-ATP酶活力急劇下降,最終達到0.108 μmol/(min·mg),與對照組相比僅提高了1 倍。當骨泥質量分數低于5.0%時,Ca2+可以與ATP酶有效結合,激活ATP酶,促進肌球蛋白與肌動蛋白結合;但當骨泥質量分數大于5.0%時,Ca2+含量急劇增加,導致蛋白質-鈣-蛋白質結構的形成,Ca2+不能有效激活ATP酶,最后造成了Ca2+-ATP酶活力隨著骨泥質量分數的增加呈現先增加后降低的趨勢[19]。

圖3 骨泥質量分數對魚糜凝膠強度的影響Fig.3 Effect of fish bone paste addition on the strength of surimi gel
由圖3可知,隨著骨泥質量分數的增加,魚糜凝膠強度呈現先升高后降低的趨勢。在骨泥質量分數為5.0%時,凝膠強度達到最大值,約為對照組的1.7 倍。當添加的骨泥質量分數大于5.0%時,魚糜凝膠強度呈現急劇下降趨勢(P<0.05),骨泥質量分數為12.5%時凝膠強度小于對照組。分析其主要原因可能為:一方面是隨著骨泥質量分數的增加,Ca2+-ATP酶活力下降,肌球蛋白與肌動蛋白不能有效結合,導致凝膠形成能力下降;另一方面是低濃度Ca2+激活魚糜中內源性谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase,TGase),促進肌原纖維蛋白交聯,而高濃度Ca2+會抑制TGase活力、影響交聯,進而使凝膠強度降低[20]。這與Hemung[21]和葉川[19]等的研究結果基本一致。

表1 骨泥質量分數對魚糜凝膠質構的影響Table1 Effect of fish bone paste addition on texture properties of surimi gel
由表1可知,除硬度、膠著度、咀嚼度3 種指標外,其他指標均無顯著差異(P>0.05)。對于硬度、膠著度、咀嚼度這3 個指標而言,其變化趨勢與凝膠強度基本一致,都呈現先增強后降低的現象。當骨泥質量分數為5.0%時,魚糜凝膠硬度與對照組相比提高了約31%,而膠著度、咀嚼度兩項指標與對照組相比分別提高了約26%和24%。當骨泥質量分數超過5.0%時,硬度、膠著度、咀嚼度數值急劇下降,口感變差。
關于魚糜凝膠色澤變化的原因鮮有報道,除了魚糜及輔料添加帶來的凝膠色澤變化外,有學者認為水的添加能提高L*值、降低b*值,而a*值與水分含量沒有顯著的關系[22]。另外,不同溫度下所測的亮度也有所不同,凝膠在25 ℃下比5 ℃下的亮度要高[23]。此外有學者發現,經過超高壓處理比加熱處理的凝膠結構更為致密,相應的魚糜凝膠的亮度與白度較高[24-25]。由表2可知,對于L*值來說,骨泥的添加可以顯著提高魚糜凝膠的亮度(P<0.05)。但是骨泥質量分數為2.5%時,魚糜凝膠的亮度與對照組相比會出現下降的情況。這可能是由于添加的骨泥與魚糜中蛋白質之間爭奪水分,使凝膠表面水分減少,亮度下降[6]。而加入質量分數5.0%的骨泥形成的凝膠結構較2.5%時更加致密,亮度會有所提高。繼續添加骨泥會導致魚糜凝膠結構松散,形成較大的孔洞,其內部的水分更容易溢出至表面,從而使得魚糜凝膠在短時間內亮度提高。而色彩指數a*值僅在骨泥質量分數大于10.0%時發生明顯的變化。當骨泥質量分數為5.0%時,其魚糜凝膠色彩指數b*值最小,但隨著骨泥質量分數的增加,b*值緩慢提高。與對照組相比,適量地添加骨泥對魚糜凝膠制品在色澤上并沒有負面影響,可以滿足消費者的感官需求。

表2 骨泥質量分數對魚糜凝膠色澤的影響Table2 Effect of fish bone paste addition on color of surimi gel
水分作為魚糜制品中含量最高的化學組分,其含量、分布狀態及穩定性關系到產品的食用品質(色澤、嫩度、多汁性、風味等)和貨架期,所以良好的凝膠持水性不僅能夠降低企業生產的成本,提高產品出品率,還可以保留更多的風味物質,因此凝膠持水性是魚糜凝膠制品的一項重要指標[26]。如圖4所示,隨著骨泥質量分數的增加,凝膠持水性呈先上升后下降的趨勢,與魚糜的凝膠強度變化趨勢基本一致。當骨泥質量分數達到5.0%時,魚糜凝膠的持水性達到最大值,與對照組相比提高了約5%(P<0.05)。但繼續添加骨泥后,凝膠持水性顯著下降(P<0.05);添加質量分數10.0%的骨泥時,魚糜凝膠的持水性較對照組降低了約4%。研究表明,凝膠持水性主要與凝膠結構密切相關。結合本研究中魚糜凝膠SEM微觀結構觀察結果可知,當骨泥質量分數達到5.0%時,魚糜凝膠形成的三維網狀結構較為致密,可以包埋更多的水分子,凝膠持水性較好。當進一步添加骨泥后,凝膠結構較為松散。出現這樣的原因可能是骨泥添加過多時,相應的魚糜中Ca2+含量增加,影響蛋白質之間緊密、有序的交聯;當骨泥質量分數逐漸提高時,大量的骨泥顆粒也隨之加入到魚糜中,阻礙了蛋白質之間的交聯,從而使形成的凝膠結構較為松散,導致凝膠持水性顯著降低[27]。

圖4 骨泥質量分數對魚糜凝膠持水性的影響Fig.4 Effect of fish bone paste addition on water-holding capacity of surimi gel

圖5 骨泥質量分數對魚糜凝膠溶解度的影響Fig.5 Effect of fish bone paste addition on solubility of surimi gel
Tris-HCl混合溶液(含有尿素、β-巰基乙醇和SDS)可以破壞魚糜凝膠網絡中除了非二硫共價鍵(主要為ε-(γ-葡萄糖)-賴氨酸(ε-(γ-Glu)-Lys)共價鍵)以外的所有共價鍵,由此測得的凝膠溶解度可以反映出ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵含量的高低[28]。ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵的存在賦予了魚糜凝膠較高的硬度和彈性。由圖5可以看出,隨骨泥質量分數的增加,魚糜凝膠的溶解度呈現先減少后增加的顯著變化趨勢(P<0.05)。當骨泥質量分數為5.0%時,魚糜凝膠的溶解度出現最小值,約92%,較對照組的溶解度降低了約5%。但進一步添加骨泥后,魚糜凝膠溶解度呈現顯著上升趨勢(P<0.05),骨泥質量分數增至12.5%時,其凝膠溶解度較對照組只降低了約2%。研究表明,Ca2+濃度對TGase活力具有顯著的影響[29],即低濃度Ca2+激活內源性TGase,催化肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)交聯,有利于魚糜中ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵的形成,而高濃度Ca2+卻抑制了TGase的活力,使得魚糜凝膠溶解度增加[30-33]。

圖6 不同骨泥質量分數的魚糜凝膠蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE patterns of proteins in surimi gel with different amounts of fish bone paste
從圖6可知,凝膠中MHC條帶窄疏,這是因為肌球蛋白是形成魚糜凝膠的主要蛋白質,在凝膠中大部分肌球蛋白發生交聯形成較大的聚集體,密集分布在分離膠的頂端。同時,與對照組相比,添加質量分數2.5%~5.0%魚骨泥的魚糜凝膠中幾乎看不到MHC條帶,說明MHC發生了充分地交聯,添加質量分數2.5%~5.0%魚骨泥促進了MHC的交聯。添加高質量分數魚骨泥后,MHC條帶又逐漸變得清晰,說明添加過量魚骨泥會影響MHC的交聯。造成這種現象的原因可能與魚骨泥中的Ca2+對魚糜中內源性TGase激活和抑制有關[27,29]。

圖7 不同骨泥質量分數的魚糜凝膠SEM圖Fig.7 SEM of surimi gels with different amounts of fish bone paste
從圖7中可以比較清楚地看到,隨著骨泥質量分數的增加,凝膠網狀結構呈現先致密后稀松的變化趨勢。當骨泥質量分數不大于5.0%時,實驗組的凝膠網狀結構明顯比對照組致密且分布均勻,這與陳海華等[34]用鈣鹽溶液漂洗提高竹莢魚魚糜凝膠強度的結果相似。但當骨泥質量分數超過5.0%后,魚糜凝膠表面不平整,內部出現較多的空洞,呈雜亂狀,三維網狀結構松散不均勻。骨泥質量分數為5.0%的魚糜凝膠表面平整,蛋白質之間相互交聯,形成致密均勻的網狀結構,優于對照組及其他實驗組。該結果與上述魚糜溶膠中Ca2+-ATP酶活力、凝膠強度、凝膠持水性等結果具有較高一致性,同時印證了上述分析。
向魚糜中添加2.5%~12.5%微細魚骨泥不影響魚糜正常凝膠的pH值。骨泥質量分數較低(不超過5.0%)時,魚骨泥中的Ca2+可以激活魚糜溶膠中肌原纖維蛋白的ATP酶,能顯著提升Ca2+-ATP酶活力;質量分數較高時使Ca2+-ATP酶活力降低。魚糜凝膠的凝膠強度、質構、持水性、色澤等指標均在添加質量分數5.0%魚骨泥時達到最高值,而凝膠溶解度在添加5.0%魚骨泥時達到最低值,說明添加質量分數5.0%魚骨泥能促進魚糜凝膠形成較多的ε-(γ-Glu)-Lys共價鍵和較為牢固的凝膠結構。SDS-PAGE結果顯示,添加質量分數2.5%~5.0%魚骨泥在一定程度上促進了MHC的交聯。SEM觀察結果顯示,添加質量分數2.5%~5.0%魚骨泥可以促進魚糜凝膠形成致密均勻的網狀結構,過量添加則會破壞凝膠網絡。綜上,添加一定量的魚骨泥(質量分數不超過5.0%)能夠促進魚糜形成較好的凝膠結構而不會影響魚糜凝膠品質。進一步研究可以考慮如何在不影響魚糜制品品質的條件下提高骨泥質量分數,以進一步提高魚骨的利用率和產品附加值。