北豆腐微生態分析及低耗水制漿技術對腐敗菌的控制

劉麗莎，趙金紅，蔣華彬，張 清，金 楊，白 潔，李玉美，彭義交*

（北京食品科學研究院，北京 100068）

北豆腐中蛋白質、脂肪、糖類含量豐富，含有異黃酮、低聚糖、大豆磷脂等功能性成分，且鈣、鎂等微量元素含量較高[1]，深受我國消費者喜愛。由于北豆腐營養豐富、水分活度高且pH值呈中性，適合微生物代謝繁殖；此外，由于原料微生物污染嚴重、自動化加工程度不高、殺菌溫度過高易影響大豆蛋白凝膠性質[2]，導致北豆腐產品貨架期極短，嚴重限制了豆制品企業的規模化發展。

豆腐中的微生物主要來源于大豆原料及加工環境，研究表明豆腐中最普遍的微生物有腸道菌、鏈球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、假單胞菌屬、穩桿菌屬、芽孢桿菌屬等[3-5]；內酯豆腐中腐敗菌為芽孢桿菌屬和屎腸球菌屬[6]；魚豆腐等豆制品中主要為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬和葡萄球菌屬[7]。目前，微生物污染及控制依舊是限制傳統豆制品發展的重要瓶頸，尤其在北豆腐加工過程中大豆浸泡工序耗時長（8～12 h），微生物快速增殖，豆漿品質不穩定，點腦需靠人工經驗值指導，標準化自動控制難以實現；大型加工企業目前大多采用流水浸泡減輕微生物的影響，但耗費大量水資源并產生大量污水；科研人員也將生物防腐劑、超高壓、微波、射線等技術引入豆制品防腐并取得一定效果[8-10]，但目前未在產業化中應用。關于豆腐腐敗方面的研究主要集中于豆腐貨架期間微生物數量及種類，針對不同腐敗菌對北豆腐的腐敗作用、加工過程腐敗菌分析及控制的報道較少。低耗水制漿技術是本團隊前期研發的具有低耗水、耗時短、低排放等優勢的綠色制漿技術，關于其對豆制品制漿過程的微生物控制作用還鮮有報道。本研究通過分離北豆腐加工貯藏期間的優勢菌，分析腐敗菌在北豆腐產品中的生長規律及腐敗作用，探明北豆腐加工過程中主要腐敗菌來源及增殖環節，并研究低耗水制漿技術對豆制品加工過程中微生物的控制作用，保障傳統豆制品加工穩定性，為豆制品加工自動化及食品安全保障提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

盒裝北豆腐 北京某豆制品加工企業；散裝北豆腐北京市西紅門市場手工作坊；微生物培養基 北京陸橋技術股份有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、細菌總DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及序列測定 北京博邁德生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ME204E分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；高壓蒸汽滅菌鍋 長沙平凡儀器儀表有限公司；DM750顯微鏡 德國Leica公司；TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國TechNet公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 北豆腐優勢腐敗菌分離純化及鑒定

1.3.1.1 優勢菌分離純化

從北豆腐菌落總數計數平皿中收集不同菌落形態的菌落進行反復劃線純化，分離主要優勢菌。

1.3.1.2 形態學鑒定

觀察菌株的菌落形態，包括大小、形態、顏色、質地、邊緣狀態及透明度等。挑取培養18～24 h長勢好的單菌落，經革蘭氏染色觀察菌體形態。

1.3.1.3 16S rDNA鑒定

采用細菌總DNA試劑盒提取腐敗菌DNA，16S rDNA鑒定引物：LPW57（5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、LPW205（5’-CTTGTTACGACTTCACCC-3’）[11]。PCR體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 11 μL，上、下游引物各1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10 μL。程序：94 ℃初始變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物純化后連接T載體測序，將結果與GenBank中收錄的其他菌株序列進行分析比對。結合菌株形態學及分子生物學對主要腐敗菌進行鑒定。

1.3.2 腐敗菌對北豆腐的腐敗作用測定

盒裝北豆腐沸水加熱20 min，將腐敗菌稀釋成105CFU/mL回接至豆腐表面，于25 ℃下貯藏，測定豆腐活菌數、理化指標及感官品質。

1.3.2.1 活菌數

無菌操作稱取北豆腐10 g，搗碎后于90 mL滅菌生理鹽水中充分振搖，體積比1∶10稀釋，用稀釋平板法測定樣品的活菌數。

1.3.2.2 pH值

用清潔小勺取北豆腐樣品，搗碎后于6 000 r/min離心5 min，用pH計測定上清液pH值。

1.3.2.3 可溶性氨基酸態氮質量分數

按GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》，取樣品5 g加50 mL水研碎，50 ℃放置10 min，離心取10 mL濾液加入70 mL水中，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.2，加入10 mL體積分數38%甲醛溶液（pH 8.2），用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 9.2，以空白水樣為對照。氨基酸態氮質量分數按下式計算。

式中：c為NaOH溶液濃度（0.1 mol/L）；V1為樣品消耗NaOH溶液體積/mL；V01為對照消耗NaOH溶液體積/mL。

1.3.2.4 感官評價

北豆腐接種腐敗菌后每隔6 h取樣，觀察其顏色、氣味、質地和產黏情況，評價豆腐腐敗程度。

1.3.3 北豆腐加工及貯藏過程的微生態分析

按北豆腐生產工序（某豆制品企業北豆腐生產線）取樣，市售盒裝及散裝北豆腐于25 ℃貯藏24 h，按GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》檢測菌落總數，根據菌落形態統計菌群數量，研究北豆腐加工及貯藏過程中的微生態。

1.3.4 低耗水制漿技術對微生物的控制作用

將相同原料分別采用如下不同工藝浸泡制漿，檢測制漿后生漿的菌落總數及腐敗菌種類，研究不同工藝對北豆腐加工過程中微生物的影響。

傳統工藝：大豆原料清洗一遍，按料液比1∶7加水浸泡12 h制漿；流水浸泡工藝：大豆原料清洗一遍，按料液比1∶7流水浸泡12 h制漿（某豆制品企業制漿生產線）；低耗水制漿技術[12]：大豆破碎脫皮，按料液比1∶7加水浸泡3 h制漿。

1.4 數據統計分析

數據采用Excel 2016軟件和SPSS 22.0軟件進行統計分析，實驗數據均重復3 次，采用Duncan法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 優勢菌的分離純化及鑒定結果

2.1.1 形態學鑒定結果

采用平板培養技術從北豆腐成品及貯藏過程中篩選分離出5 類菌落形態不同的優勢菌（圖1），分別命名為BDF-1～5。

圖1 腐敗菌菌落形態圖Fig.1 Colonial morphology of spoilage bacteria

BDF-1為白色針尖狀小菌落，顯微鏡下鑒定為革蘭氏陽性鏈球菌；BDF-2在固體培養基上生長時呈不規則假根狀，邊緣呈羽毛狀，表面干燥，革蘭氏染色呈陽性，幼齡培養物桿狀，長時間培養出現球狀細胞；BDF-3為較大乳白色圓形菌落，革蘭氏染色呈陰性；BDF-4為典型的黃色菌落，邊緣整齊，表面濕潤，光滑有光澤，顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性球桿菌；BDF-5為圓形白色菌落，邊緣不整齊，表面微皺，革蘭氏染色為陽性桿菌，產芽孢。

2.1.2 16S rDNA序列同源性分析結果

分別提取5 株優勢菌的總DNA，利用細菌16S rDNA基因為目標片段，擴增獲得1 400 bp左右（1 420、1 452、1 420、1 384、1 420 bp）特異性擴增條帶，經測序后5 株菌的16S rDNA測序結果在美國國立生物技術信息中心網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BLASTN比對確定屬，結果如表1所示。

表1 腐敗菌16S rDNA鑒定Table1 Identification of spoilage bacteria by 16S rDNA gene sequence analysis

2.2 優勢菌對北豆腐的腐敗作用

北豆腐因營養豐富，水分含量高，適宜微生物快速增殖，在豆腐腐敗過程中，部分種類的微生物將占據優勢，大量增殖生成代謝產物使豆腐產生臭味、黏液、顏色變化及變軟等現象，此類微生物被稱為特定腐敗菌。目前國內外報道的豆腐腐敗菌主要是庫特氏菌、腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌屬等細菌，由于原料和加工環境的差別，報道的菌群有較大差異。本研究將分離到的5 株優勢菌反接至豆腐，研究其對北豆腐的腐敗作用。

2.2.1 優勢菌在豆腐中的增殖規律

圖2 優勢菌在北豆腐貯藏過程中的變化Fig.2 North Chinese of curves of bacteria in tofu during storage

圖2表明，豆腐接種5 種腐敗菌后在25 ℃貯存，微生物快速增殖。BDF-3（產氣腸桿菌）生長速率最快，在6 h時達107CFU/g，北豆腐已有異味，至24 h時，BDF-3活菌數達109CFU/g，樣品已嚴重腐敗。BDF-2（吉氏庫特氏菌）、BDF-5（枯草芽孢桿菌）在6 h后進入快速生長期，于12 h時達108CFU/g左右，此時接種BDF-2、BDF-5的樣品已有輕微異味，至24 h時已嚴重腐敗，散發惡臭。BDF-1（乳酸乳球菌）在6 h后快速增殖，于12 h時達107CFU/g，18 h時達109CFU/g，除產生酸味外，對樣品其余性質無明顯影響。BDF-4（短穩桿菌）生長較為遲緩，至18 h時樣品產生品質劣變，活菌數接近107CFU/g，貯藏24 h時活菌數近108CFU/g，產生惡臭味，短穩桿菌目前主要應用于微生物殺蟲劑，可能隨原料進入豆制品加工環節[13]。

2.2.2 優勢菌對豆腐pH值的影響

圖3 優勢菌對貯藏期間豆腐pH值的影響Fig.3 Effect of dominant bacteria on pH of tofu during storage

如圖3所示，北豆腐在初始6 h內pH值無明顯變化。6 h后，接種BDF-1的北豆腐pH值明顯下降，放置24 h后其pH值降至4.5。接種BDF-3和BDF-5的樣品pH值小幅下降，24 h后pH值為5.8左右。北豆腐pH值下降可能是微生物利用碳水化合物產生乳酸、乙酸等有機酸所致[14]。據報道，乳酸乳球菌、產氣腸桿菌有較強產酸能力[15-16]，可使樣品pH值迅速下降。BDF-4對北豆腐pH值影響較小，其pH值保持相對穩定。接種BDF-2的樣品貯藏24 h后pH值升至6.4，可能是由于豆腐富含蛋白質，微生物代謝產生堿性胺類化合物，從而導致其pH值上升[17-18]。

2.2.3 優勢菌對可溶性氨基酸態氮質量分數的影響

圖4 優勢菌對貯藏期間豆腐可溶性氨基酸態氮質量分數的影響Fig.4 Effect of dominant bacteria on soluble amino nitrogen content of tofu during storage

氨基酸態氮質量分數是蛋白質水解程度的一個重要指標，其質量分數越高表明蛋白質水解越嚴重[19]。圖4表明，隨著北豆腐貯藏時間延長，其可溶性氨基酸態氮質量分數不斷升高。貯藏24 h時，氨基酸態氮質量分數由高至低依次為BDF-5、BDF-3、BDF-2、BDF-4、BDF-1。接種BDF-1的樣品氨基酸態氮質量分數基本保持穩定，稍有上升。接種其余菌株的樣品氨基酸態氮質量分數均有明顯上升，其中BDF-3、BDF-5增加最為迅速。據報道，產氣腸桿菌和枯草芽孢桿菌產蛋白酶能力較強[20]，微生物通過分泌蛋白酶水解蛋白質產生氨基酸，破壞由7S、11S球蛋白形成的三維網絡結構，將豆腐腐化成軟泥狀[21]。

2.2.4 感官評價結果

表2 北豆腐感官評價結果Table2 Sensory evaluation of north Chinese tofu

圖5 貯藏24 h時的豆腐樣品Fig.5 Tofu samples during storage for 24 h

北豆腐樣品初始狀態均為乳白色，表面濕潤，有彈性、無黏液、無異味。隨著微生物的繁殖，豆腐的顏色、質地及風味產生了顯著變化。表2及圖5表明，乳酸乳球菌（BDF-1）對北豆腐色澤及質地影響較小，其不產生黏液及色素，于25 ℃放置24 h，豆腐仍保持乳白色及原有質地；其產酸能力強，樣品放置18 h時開始有較明顯的酸味；產蛋白酶能力弱，對豆腐蛋白質凝膠結構破壞較小，僅彈性降低、硬度變大，可能與pH值下降引起豆腐凝膠收縮有關。接種庫特氏菌（BDF-2）的豆腐從18 h時開始表面出現黃膜，至24 h時已覆滿鵝黃色黏膜，質地變軟，從12 h時開始出現餿味。產氣腸桿菌（BDF-3）、短穩桿菌（BDF-4）和枯草芽孢桿菌（BDF-5）均能使豆腐顏色變為灰黃色，放置24 h時豆腐成泥狀，這與菌株生長過程中水解大豆蛋白破壞原有凝膠結構有關，樣品質地的腐壞速率與氨基酸態氮質量分數變化趨勢一致。此外菌株在代謝過程中催化氨基酸脫羧，生成生物胺、氨氣、吲哚、硫化物等[22]，嚴重影響產品品質及安全性。

根據豆腐樣品感官評價與微生物生長趨勢分析，微生物增長速率與豆腐腐敗速率（樣品感官品質劣變程度）一致，當腐敗菌數量增長到107CFU/g時，樣品感官品質出現明顯劣變，為食品能被接受的最大微生物限量值[23]，腐敗速率由快至慢為產氣腸桿菌（BDF-3）、庫特氏菌（BDF-2）、枯草芽孢桿菌（BDF-5）、乳酸乳球菌（BDF-1）、短穩桿菌（BDF-4）。

2.3 北豆腐貯藏過程中的微生態分析

蛋白類食品的防腐保鮮技術一直是科研人員關注的重點及難點，由于大豆蛋白對溫度較敏感，溫度過高易導致蛋白變性影響其凝膠特性[24]，豆腐類產品難以徹底殺菌。不同包裝形式的北豆腐微生物污染情況有顯著差異（P＜0.05）。經高溫殺菌處理的盒裝產品菌落總數為（3.3±0.5）×102CFU/g，當天生產的散裝北豆腐菌落總數高達（1.3±0.1）×105CFU/g，遠超過盒裝產品（P＜0.05）。樣品經25 ℃貯藏24 h，散裝和盒裝北豆腐菌落總數分別達（2.9±0.3）×109CFU/g和（1.0±0.1）×108CFU/g，樣品已腐敗變質。豆腐類產品蛋白質含量豐富，水分含量高，適合微生物繁殖[25]，且北豆腐基本為敞開式加工，原料、設備及加工環境中的微生物均會污染產品。散裝豆腐成型后無殺菌措施且無冷鏈保藏，產品微生物污染更為嚴重，存在較大的食品安全問題；盒裝豆腐成品經殺菌后仍需冷鏈運輸、銷售，才能保證北豆腐產品的品質及安全性，但貨架期較短。

圖6 北豆腐貯藏過程微生態分析Fig.6 Changes in bacterial counts of north Chinese tofu during storage

如圖6所示，5 類主要腐敗菌均可在散裝產品中檢測到，盒裝豆腐經殺菌后，生物多樣性明顯小于散裝豆腐，僅能檢測到乳酸乳球菌。樣品經25 ℃貯藏24 h后完全腐敗，BDF-1和BDF-2快速增殖，為散裝和盒裝北豆腐的主要腐敗菌，散裝產品中利用本研究方法未檢出BDF-3～5（活菌數小于106CFU/g）。乳酸乳球菌發酵產酸導致樣品pH值大幅下降，此外，其能產生抑菌代謝產物或信號分子抑制其余微生物繁殖[26]。乳酸菌是豆制品加工及貯藏中普遍存在的一類微生物，傳統酸漿豆腐即利用乳酸菌發酵酸漿作為酸凝固劑[27]。庫特氏菌在吳麗櫻報道的3 種品牌豆腐中均有檢出[28]，也是本研究中散裝和盒裝北豆腐的主要腐敗菌，該菌可能在北豆腐產品中普遍存在，但在未腐敗豆腐中并不占優勢，溫度適宜時其快速增殖造成北豆腐腐敗，針對該菌污染來源及毒理學等方面的報道較少。腸桿菌、短穩桿菌和芽孢桿菌在盒裝北豆腐成品中未檢出，但存在于散裝北豆腐產品中，與其他研究中報道的豆制品中常見腐敗微生物一致[5,23,28]。

2.4 北豆腐加工過程中的微生態分析及控制

2.4.1 北豆腐加工過程的微生態分析

圖7 盒裝北豆腐加工環節微生態分析Fig.7 Bacterial community analysis of packaged north Chinese tofu during processing

如圖7所示，在盒裝北豆腐加工過程中，浸泡、生漿工序的微生物數量最高（大于105CFU/g），生物多樣性最豐富，優勢菌為乳酸乳球菌（BDF-1）、產氣腸桿菌（BDF-3）和短穩桿菌（BDF-4）。我國傳統豆制品加工一般選用蛋白質含量較高的國產大豆，在田間收獲后未經篩選、除雜、清洗等處理，大豆原料攜帶大量微生物進入浸泡環節[28-29]，經10～12 h流水浸泡，蛋白質、糖類物質溶出，微生物大量繁殖（105CFU/g），溫度較高時，微生物快速繁殖產酸導致pH值下降，還可能產生胺類等有害成分，嚴重影響豆漿加工穩定性及安全性。

熟漿的微生物數量最低（24 CFU/g），與李博[6]、石彥國[30]等的報道一致，這是因為大部分微生物被殺滅，僅殘留少量乳酸乳球菌。點腦成型過程溫度高，微生物數量變化不顯著（P＞0.05）。豆腐成型后經冷卻、分割、包裝，微生物數量顯著上升（至104CFU/g），主要為乳酸乳球菌和產氣腸桿菌，這是由于北豆腐為敞開式加工，設備、包布、冷卻水、環境中微生物容易污染產品。包裝后北豆腐經巴氏殺菌，微生物數量顯著降低（至102CFU/g），不耐熱微生物基本被殺滅，冷鏈條件下貨架期可保持7 d，在常溫下不足1 d。

庫特氏菌在加工過程并未檢出，但在散裝及盒裝產品中均出現。據報道，庫特氏菌主要存在于雞糞、不流動淡水、肉制品、牛乳中[31]，曾在豆腐切割刀上檢出[28]，豆腐成品中的庫特氏菌可能是成型后冷卻、分割過程中由設備及冷卻水帶入，在加熱過程中未完全殺滅，在適宜溫度下快速增殖，成為豆腐的主要腐敗菌。

2.4.2 不同浸泡工藝對制漿過程中微生物增殖的影響

圖8 不同浸泡工藝對制漿過程中微生物增殖的影響Fig.8 Effect of different pulping technologies on microbial proliferation in soymilk during processing

大豆浸泡過程中的微生物主要為乳酸乳球菌、產氣腸桿菌、短穩桿菌三大類，主要來源于大豆原料，散裝產品由于殺菌程度低，這3 類菌均能在成品中檢出，盒裝產品殺菌較為徹底，乳酸乳球菌為主要優勢菌。前期研究證實，乳酸乳球菌和產氣腸桿菌在豆漿中發酵產酸使蛋白凝聚，短穩桿菌產生黃色菌膜，3 類腐敗菌都會嚴重影響豆漿的加工穩定性和產品品質[32]。

圖8表明，低耗水制漿技術可大幅降低原料微生物數量，菌落總數從傳統工藝的3.7×105CFU/g降至8.6×103CFU/g（P＜0.05）。大豆原料攜帶的微生物主要來源于種皮[29]，采用低耗水制漿技術的原料經前處理脫皮，可有效降低原料中攜帶的各類微生物數量。

傳統大豆制漿技術由于耗時長（12 h），微生物增殖迅速，制漿后菌落總數達2.3×108CFU/g，溫度較高時，微生物腐敗速率更快，對豆漿品質影響更為顯著。大型豆制品加工廠為保證產品品質及安全性，采用流水浸泡制漿技術將微生物總數控制在105～106CFU/g，但此工藝耗水量及污水排放量巨大，給企業造成極大的經濟負擔和環境壓力。低耗水制漿技術由于破碎后的大豆顆粒較小，吸水面積增加，蛋白質吸水迅速，3 h即可完成浸泡；且由于原料污染程度降低，制漿結束后菌落總數（7.0×104CFU/g）較傳統工藝和流水浸泡工藝顯著下降（P＜0.05），與傳統工藝浸泡初始階段相當。低耗水制漿技術制漿過程中微生物污染少且繁殖慢，無需換水，浸泡用水可直接用于磨漿，可大幅降低工藝耗水量及污水排放量，有利于傳統豆制品加工行業的可持續發展；此外，由于耗時短，微生物對豆漿的水解腐敗作用較小，豆漿的加工穩定性和安全性得以保障，有利于豆制品加工過程的標準化自動控制。

3 結 論

本研究考察市售散裝及盒裝北豆腐微生物污染及多樣性，發現散裝北豆腐成品菌落總數高，微生物種類繁多，盒裝北豆腐經殺菌處理，微生物多樣性較單一，主要為乳酸乳球菌。從北豆腐成品中分離出5 株優勢菌，經16S rDNA鑒定為乳酸乳球菌、吉氏庫特氏菌、產氣腸桿菌、短穩桿菌及枯草芽孢桿菌。腐敗菌回接實驗表明，微生物數量達107CFU/g時，豆腐開始產生較明顯的腐敗現象，乳酸乳球菌產酸使豆腐pH值下降，其余4 種優勢菌可導致北豆腐顏色變化、質地變軟、產生不良氣味，嚴重影響產品品質及安全性。

豆制品企業加工過程浸泡、制漿工序中由于原料攜帶大量微生物且條件適宜，微生物污染嚴重，主要污染微生物為乳酸乳球菌、產氣腸桿菌和短穩桿菌，經煮漿后微生物數量大幅下降，僅為24 CFU/g，經點腦、壓榨成型、冷卻、分割后的成品微生物數量上升，經殺菌后成品微生物數量控制在102CFU/g。本研究發現，通過低耗水制漿技術可減少工藝用水量并縮短耗時，有效控制浸泡及制漿過程中微生物數量，降低加工過程中微生物對產品加工穩定性及安全性的影響，為傳統豆制品的標準化控制及工業化生產提供依據。