6 種糖-酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析

孫 穎，張莉莉，張玉玉*，孫寶國，陳海濤

（北京工商大學材料與機械工程學院，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，食品質量與安全北京實驗室，北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048）

5-羥甲基糠醛是食品在熱處理、發酵等加工過程中形成的毒素，蜂蜜[1]、牛奶[2]、咖啡[3]、酒類[4]、焦糖[5]、調味品[6]、干果[7]等食品中均含有5-羥甲基糠醛。國際果汁生產商聯合會規定：果汁中5-羥甲基糠醛的含量不應超過25 mg/kg[8]。在食品的熱加工過程中，5-羥甲基糠醛可以由2 種途徑生成：一種是美拉德反應途徑；另一種是焦糖化反應途徑[9]。葡萄糖通過置換反應生成席夫堿，再生成1,2-果糖胺，加成消除生成1,2-二酮糖；同樣地，葡萄糖加氫還原生成1,2-烯二醇，1,2-烯二醇和葡萄糖、果糖發生脫水反應可以生成5-羥甲基糠醛形成過程中的關鍵中間體——3-脫氧鄰酮糖。3-脫氧鄰酮糖進一步脫水環化，也能夠生成1,2-二酮糖，最終形成5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛的含量與熱處理的溫度、熱處理的時間呈正相關關系。研究稱，在干燥和熱解條件下，蔗糖可以分解成游離的葡萄糖和高活性呋喃果糖基離子，呋喃果糖基離子可以直接轉化成5-羥甲基糠醛。在超過250 ℃時，呋喃果糖基離子可以迅速生成5-羥甲基糠醛[10]。

研究人員在天然產物土茯苓、羅漢果浸膏、蜜制麻黃、長裙竹蓀甲醇提取物以及炮制五味子中也檢測到了5-羥甲基糠醛[11]。含糖量較高的食品在加工和保存過程中，不可避免地會產生5-羥甲基糠醛。因此，5-羥甲基糠醛的含量可以用作水果、咖啡、蜂蜜、牛奶等食品的質量標記，同時還可以用于監測谷物產品的加熱過程[12]。在食品行業中得到廣泛應用的轉化糖漿是由蔗糖通過酸水解形成的，在此過程中，同時也會發生焦糖化反應、還原糖的分解反應以及美拉德反應[13]。這些反應同時發生并且互相影響，從而使得反應進程及生成物十分復雜。此時，反應過程中產生的5-羥甲基糠醛可以作為指示劑，指示反應的程度[14]。在權衡蜂蜜品質時也是以5-羥甲基糠醛的含量為指標，其能夠評估蜂蜜的新鮮程度及加工處理貯藏水平的優劣[15]。5-羥甲基糠醛含量高表明蜂蜜熱加工過度，或者貯存時間過長，貯存條件較差等。在評估果蔬汁產品的品質時，5-羥甲基糠醛也已經成為一個重要的品質評價指標[16-17]。在含糖量高的食品中，5-羥甲基糠醛對其風味、顏色、口感、外觀有很大的影響，同時也會降低食品的食用安全性[18]。5-羥甲基糠醛很少存在于新鮮和未經加工的食品中，同時它的含量能夠隨著熱處理或者貯存時間的延長而增加[19]。5-羥甲基糠醛的含量與食品存放的容器、加工和貯藏條件、原料的特性（pH值、總酸和金屬離子含量）、濕度、光等因素有很大的關系[20]。各類食品如蜂蜜、飲品、甜品、藥品、乳制品、調味品中5-羥甲基糠醛的含量差別較大。

目前對肉味香精制備過程中的糖-酶解液體系5-羥甲基糠醛形成的動力學研究較少。本實驗以肉味香精制備過程中的糖-酶解液體系為研究對象，研究體系中糖種類、糖添加量、加熱時間、加熱溫度等因素對5-羥甲基糠醛形成的影響；通過對糖-酶解液體系中5-羥甲基糠醛形成量的實驗測定和數據擬合，揭示其形成5-羥甲基糠醛的動力學特征，旨在為研究熱加工香精中5-羥甲基糠醛的形成過程提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后尖、三黃雞、牛腩為市售；葡萄糖 冀州市華陽化工有限責任公司；蔗糖 北京羽利興商貿有限公司；中性蛋白酶、動物蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶（20萬 U/g） 南寧龐博生物有限公司；5-羥甲基糠醛（色譜純） 美國Sigma公司；甲醇（色譜純）美國Fisher控制設備國際有限公司；戊烷、己烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；超純水由Milli-Q Integral純水/超純水一體化系統制備。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀（配有Quat Pump洗脫泵、ALS自動進樣器、TCC柱溫箱、DAD檢測器、OpenLAB CDS工作站） 美國安捷倫科技有限公司；Venusil XBP-C18(L)色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 博納艾杰爾科技有限公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液的制備

1.3.1.1 豬肉酶解液的制備

豬肉酶解液的制備參考文獻[21]。將新鮮去皮豬后尖切成2 cm×2 cm×2 cm左右的肉塊，進絞肉機絞成肉餡，依照m（豬肉）∶m（水）＝2∶3加入超純水并混合均勻，在水浴加熱下攪拌，待混合液到達指定溫度50 ℃時，加入0.25%（質量分數，下同）中性蛋白酶和0.08%動物蛋白酶進行酶解，80 min后，升溫至90 ℃，維持10 min滅酶活力，停止加熱，室溫冷卻，收集備用。

1.3.1.2 牛肉酶解液的制備

牛肉酶解液的制備參考文獻[22]。將牛肉絞碎，按照m（牛肉）∶m（水）＝3∶4加入超純水并混合均勻，水浴加熱下攪拌，待混合液到達45 ℃時，加入0.10%風味蛋白酶進行酶解、酶解時間3 h。酶解結束后，迅速升溫至100 ℃，維持10 min滅酶活力，停止加熱，室溫冷卻，收集備用。

1.3.1.3 雞肉酶解液的制備

雞肉酶解液的制備參考文獻[23]。將雞身剁碎，按照m（皮）∶m（肉）∶m（骨）＝1∶4∶2，分別放入絞肉機中進一步絞碎，按照m（雞肉）∶m（水）=1.5∶1.0加入超純水并混合均勻，水浴加熱下攪拌，待混合液到達50 ℃時，加入0.20%中性蛋白酶進行酶解、酶解2.5 h后，升溫至90 ℃，維持10 min滅酶活力，停止加熱，室溫冷卻，收集備用。

1.3.2 模型體系的制備

分別稱取豬肉、牛肉、雞肉酶解液50 g于四口燒瓶中，分別加入10 g葡萄糖和蔗糖，油浴條件下加熱到指定溫度（90～110 ℃），分別加熱回流0、1、2、3、4、5、6 h，進行美拉德反應。樣品預處理后，經0.45 μm過濾膜過濾，待高效液相色譜儀檢測。糖-酶解液模型體系單因素試驗的因素及水平如表1所示，糖-酶解液模型體系動力學實驗設計梯度溫度分別為90、95、100、105、110 ℃，各溫度下分別加熱0、1、2、3、4、5、6 h。

表1 單因素試驗設計Table1 Independent variables and their levels used in one-factor-at-a-time design

1.3.3 5-羥甲基糠醛含量的測定

將糖-酶解液于4 ℃冷藏靜置過夜，然后于4 ℃離心去除油脂層，重復3 次，得脫脂液。取脫脂液和甲醇按質量比1∶1混勻，靜置10 min，9 600 r/min、4 ℃條件下離心15 min，沉淀蛋白，取上清液。上清液經0.45 μm濾膜過濾后，待高效液相色譜儀測定分析。

液相色譜條件為：Venusil XBP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；UV檢測器，檢測波長284 nm；甲醇-超純水質量比5∶95，等梯度洗脫；流動相流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測時間25 min。

1.4 數據處理

模擬體系中5-羥甲基糠醛含量的變化規律用零級動力學模型和一級動力學模型兩種動力學模型進行分析，分別見公式（1）、（2）。

式中：Ct代表5-羥甲基糠醛在任意時間的含量/（mg/kg）；C0為該5-羥甲基糠醛的起始含量/（mg/kg）；t為反應時間/h；k0和k1為速率/h-1。

2 結果與分析

2.1 糖添加量對5-羥甲基糠醛含量的影響

圖1 糖添加量與模型中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.1 Effect of sugar concentration on the formation of 5-HMF

由圖1可知，5-羥甲基糠醛的含量與糖添加量呈現出正相關關系，在單糖體系[24]、蛋糕體系[25]中，5-羥甲基糠醛含量隨著糖添加量的增加而積累。在葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量最高，其次是葡萄糖-雞肉酶解液模型體系、葡萄糖-牛肉酶解液模型體系。其中葡萄糖-豬肉酶解液模型體系、葡萄糖-雞肉酶解液模型體系、葡萄糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量分別由（53.131±0.288）、（4.274±0.028）、（8.982±0.176）mg/kg增加至（533.505±4.870）、（523.341±14.189）、（166.006±0.895）mg/kg。葡萄糖-雞肉酶解液模型體系中，葡萄糖的添加量大于10 g時，5-羥甲基糠醛在葡萄糖-雞肉酶解液中含量呈現出較為明顯的積累。蔗糖-豬肉酶解液模型體系、蔗糖-雞肉酶解液模型體系、蔗糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的含量受糖添加量的影響較小。

2.2 加熱溫度對5-羥甲基糠醛含量的影響

圖2 加熱溫度與模型中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.2 Effect of temperature on the formation of 5-HMF

5-羥甲基糠醛在單糖溶液模型體系中主要是通過焦糖化反應產生的，然而在復雜的糖-酶解液的體系中，5-羥甲基糠醛的生成途徑則相對較多。由圖2可知，在90～110 ℃的溫度范圍內，在葡萄糖-豬肉酶解液體系中5-羥甲基糠醛的含量隨著加熱溫度的升高而快速積累，蔗糖參與的模型體系中5-羥甲基糠醛的含量均較葡萄糖參與的模型體系低。在葡萄糖與豬肉酶解液體系中，溫度為90～100 ℃時，5-羥甲基糠醛含量的增長趨勢相對平緩，100 ℃之后增長較迅速，由（510.146±0.817）mg/kg（100 ℃）增加至（1 569.920±47.293）mg/kg（110 ℃）。其余5 種模型體系中5-羥甲基糠醛含量的增長趨勢均相對平緩，5-羥甲基糠醛在葡萄糖與豬肉酶解液體系中更容易生成。5-羥甲基糠醛的生成在較低的加熱溫度下，是一個逐步積累的過程[26]。

2.3 加熱時間對5-羥甲基糠醛含量的影響

由圖3可知，在加熱時間逐步延長的過程中，模型體系中的5-羥甲基糠醛含量逐步增加。與加熱溫度、糖添加量模型體系相同，葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量的變化最明顯，從（12.112±0.237）mg/kg增加至（1 210.408±3.735）mg/kg。在此模型體系中，加熱時間為0～3 h時，5-羥甲基糠醛的積累相對緩慢，隨后5-羥甲基糠醛的積累相對迅速，由（251.889±2.110）mg/kg（3 h）增加至（1 210.408±3.735）mg/kg（6 h）。相比之下，葡萄糖-牛肉酶解液模型體系、葡萄糖-雞肉酶解液模型體系、蔗糖-豬肉酶解液模型體系、蔗糖-牛肉酶解模型體系、蔗糖-雞肉酶解模型體系中5-羥甲基糠醛的生成量受時間影響較小，但仍呈現出隨時間延長而增加的趨勢。5-羥甲基糠醛的含量在蜂蜜樣品中也是與時間的推移呈正相關關系[27]。

圖3 加熱時間與模型中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.3 Effect of heating time on the formation of 5-HMF

2.4 葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析

圖4 加熱溫度、時間與葡萄糖-豬肉酶解液模型中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.4 Effect of heating temperature and time on the formation of 5-HMF in glucose-pork protein hydrolysate system

表2 葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析Table2 Kinetic analysis of 5-HMF formation in glucose-pork protein hydrolysate system

由圖4可知，在0～3 h內，5 個溫度下，模型體系中的5-羥甲基糠醛含量均呈現出緩慢的積累，3 h后，100、105、110 ℃體系中5-羥甲基糠醛的累積速率增大，5-羥甲基糠醛的含量呈現出顯著的積累，其中110 ℃條件下增長最快，6 h時，5-羥甲基糠醛的形成量達到2 517.062 mg/kg，且仍有增長趨勢。在較低溫度（90、95 ℃）條件下，0～6 h內，模型體系中5-羥甲基糠醛逐步積累。葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的生成動力學分析如表2所示，5 個溫度梯度下，葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的生成量與加熱時間均呈線性關系，符合零級動力學模型。葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的生成速率與加熱溫度呈現出正相關的規律，速率從35.576 h-1（90 ℃）升高至477.800 h-1（110 ℃）。

2.5 蔗糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析

圖5 加熱溫度、加熱時間與蔗糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.5 Effect of heating temperature and time on the formation of 5-HMF in sucrose-pork protein hydrolysate system

表3 蔗糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析Table3 Kinetic analysis of 5-HMF formation in sucrose-pork protein hydrolysate system

從圖5和表3可以看出，在5 個溫度下，蔗糖-豬肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的含量均與加熱時間呈現出正相關的關系。由動力學分析得出在90、95、100、105、110 ℃條件下，0～6 h內，5-羥甲基糠醛的生成量在蔗糖-豬肉酶解液模型體系中與加熱時間均呈線性關系，符合零級動力學模型；該模型體系與葡萄糖-豬肉酶解液模型體系相比，5-羥甲基糠醛的生成量和生成速率均較低。

2.6 葡萄糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析

從圖6可以看出，在0～1 h（110 ℃除外），5-羥甲基糠醛在葡萄糖-牛肉酶解液模型體系中的含量呈現出相對緩慢的累積，在1～3 h，5-羥甲基糠醛的累積速率較快，3～6 h，5-羥甲基糠醛仍表現出累積趨勢，但速率有所減緩。由表4可以看出，在5 個溫度下5-羥甲基糠醛的生成量均與加熱時間呈現出正相關的關系。由動力學分析得出在90、95、100、105、110 ℃條件下，5-羥甲基糠醛在葡萄糖-牛肉酶解液模型體系中的生成量與加熱時間均呈線性關系，符合零級動力學模型。

圖6 加熱溫度、加熱時間與葡萄糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.6 Effect of heating temperature and time on the formation of 5-HMF in glucose-beef protein hydrolysate system

表4 葡萄糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析Table4 Kinetic analysis of 5-HMF formation in glucose-beef protein hydrolysate system

2.7 蔗糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析

圖7 加熱溫度、加熱時間與蔗糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.7 Effect of heating temperature and time on formation of 5-HMF in sucrose-beef protein hydrolysate system

從圖7可以看出，在0～1 h，5-羥甲基糠醛在蔗糖-牛肉酶解液模型體系中的含量呈現出相對遲緩的積累，1～2 h，5-羥甲基糠醛含量呈現出較為顯著的增長。由表5可以看出，在5 個溫度下5-羥甲基糠醛在蔗糖-牛肉酶解液模型體系中的生成量均與加熱時間呈現正相關規律。由動力學分析得出在90、95、100、105、110 ℃條件下，5-羥甲基糠醛在蔗糖-牛肉酶解液模型體系中的生成量與加熱時間均呈線性關系，符合零級動力學模型。隨著溫度的升高，模型體系中5-羥甲基糠醛形成的速率增大，由0.421 9（90 ℃）增長至4.571 6（110 ℃）。

表5 蔗糖-牛肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析Table5 Kinetic analysis of 5-HMF formation in sucrose-beef protein hydrolysate system

2.8 葡萄糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析

圖8 加熱溫度、加熱時間與葡萄糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.8 Effect of heating temperature and time on the formation of 5-HMF in glucose-chicken protein hydrolysate system

表6 葡萄糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析Table6 Kinetic analysis of 5-HMF formation in glucose-chicken protein hydrolysate system

從圖8和表6可以看出，在5 個溫度下5-羥甲基糠醛在葡萄糖-雞肉酶解液模型體系中的形成量均隨著時間的延長呈現出增長趨勢。由動力學分析得出在90、95、100、105、110 ℃條件下，葡萄糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成量與加熱時間均成線性關系，符合零級動力學模型。

2.9 蔗糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析

從圖9可以看出，90、95、100 ℃條件下，0～6 h內5-羥甲基糠醛在蔗糖-雞肉酶解液模型體系中的含量增長較為緩慢；105、110 ℃條件下，0～1 h，5-羥甲基糠醛增長較為緩慢，1～6 h，5-羥甲基糠醛的生成量較多，且增長速率遠大于0～1 h。總體來說，在5 個溫度下5-羥甲基糠醛在蔗糖-雞肉酶解液模型體系中的生成量均與加熱時間呈現出正相關關系。由表7動力學分析得出，在90、95、100、105、110 ℃條件下，蔗糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的生成量與加熱時間均呈線性關系，符合零級動力學模型。

圖9 加熱溫度、加熱時間與蔗糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛含量的關系Fig.9 Effect of heating temperature and time on the formation of 5-HMF in sucrose-chicken protein hydrolysate system

表7 蔗糖-雞肉酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的形成動力學分析Table7 Kinetic analysis of 5-HMF formation in sucrose-chicken protein hydrolysate system

不同種類的糖、加熱時間、加熱溫度對5-羥甲基糠醛在不同體系中的生成量影響差別較大。因此動力學模型也不盡相同。張玉玉等[28-29]先后研究了5-羥甲基糠醛在單糖、雙糖溶液體系中的動力學模型，發現在單糖溶液體系中，葡萄糖、果糖和半乳糖在加熱溫度為80、100、120 ℃時，5-羥甲基糠醛的生成量符合一級動力學模型；在雙糖溶液體系中，乳糖、蔗糖和麥芽糖在加熱溫度為80、100 ℃時，5-羥甲基糠醛的生成量符合零級動力學模型[30]。可見，選用的糖種類及考察的體系不同，5-羥甲基糠醛形成的動力學模型也不同。在蛋糕的烘焙過程中，隨著溫度的升高和時間的延長，5-羥甲基糠醛的含量與蛋糕的pH值成反比。5-羥甲基糠醛在蛋糕中的生成量符合一級動力學模型[24]。溫度對5-羥甲基糠醛的生成有著十分重要的影響，在糖-酶解液模型體系中，葡萄糖-豬肉酶解液模型體系中110 ℃（6 h），5-羥甲基糠醛的生成量為2 517.062 mg/kg，遠遠超過了GB/T 18796—2005《蜂蜜》對蜂蜜中5-羥甲基糠醛的限量（40 mg/kg）。由于在較高的反應溫度下，烯醇縮合反應以及相關的水解和脫水反應過程均相對容易發生，使得較高的反應溫度能夠加快反應速率。所以，提倡在確定肉味香精的熱加工溫度時，應盡量選取較低的熱加工溫度，可以有效地降低5-羥甲基糠醛的生成。

在90～110 ℃條件下，葡萄糖參與的模型體系中5-羥甲基糠醛的生成量均高于蔗糖參與的模型體系，由此可以看出，在此溫度范圍下，單糖參與的模型體系形成的5-羥甲基糠醛的量和速率遠大于雙糖。但也有研究報道，在超過250 ℃ 的條件下烘烤餅干，蔗糖模型體系中5-羥甲基糠醛的生成量遠大于葡萄糖模型體系中的生成量，分析緣由應該是蔗糖在250 ℃的條件下產生了呋喃果糖基離子，而具備較高活性的呋喃果糖基離子可以直接轉化成5-羥甲基糠醛，這就加快了蔗糖參與的模型體系中5-羥甲基糠醛的生成速率[31]。所以在肉味香精的制備過程中，應盡量根據加熱時間和溫度，選擇合適的糖及添加量，以降低產品中5-羥甲基糠醛的含量。

5-羥甲基糠醛的形成量與糖添加量、加熱時間和加熱溫度有關，6 種糖-酶解液熱反應模型體系中5-羥甲基糠醛的生成量與糖添加量、加熱溫度、加熱時間均呈現出正相關規律。因此，在制備肉味香精時，應盡量降低糖的添加量，并選用較低的加熱溫度和較短的加熱時間，從而減少5-羥甲基糠醛在肉味香精產品中的積累。

3 結 論

本實驗建立了葡萄糖-豬肉酶解液、葡萄糖-牛肉酶解液、葡萄糖-雞肉酶解液、蔗糖-豬肉酶解液、蔗糖-牛肉酶解液、蔗糖-雞肉酶解液模型體系，研究了5-羥甲基糠醛的形成動力學，結果顯示：5-羥甲基糠醛的生成量與糖添加量、糖種類、加熱時間和加熱溫度有關；加熱溫度為90～110 ℃、加熱時間為0～6 h的條件下，5-羥甲基糠醛的形成量與加熱時間均符合零級動力學模型；5-羥甲基糠醛在糖-酶解液模型體系中的含量與加熱時間呈現出正相關規律，并且在葡萄糖-酶解液模型體系中5-羥甲基糠醛的積累遠遠高于蔗糖-酶解液模型體系。所以，在香精的加工過程中，盡量選擇較低的熱處理溫度、較短的熱處理時間以及用蔗糖代替葡萄糖的方式，以有效減少5-羥甲基糠醛的形成。