高溫處理對牛肉蛋白質化學作用力及肌原纖維蛋白結構的影響

康懷彬，鄒良亮，張慧蕓，蔡超奇，王 波，柯海瑞

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學 食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023）

高溫肉制品（如醬牛肉等）是指加熱介質溫度高于100 ℃（通常為115～121 ℃）、中心溫度高于115 ℃并恒定適當時間的肉制品，具有營養衛生、食用方便、攜帶方便等特點，深受消費者喜愛[1]。加熱是肉制品加工過程中最重要的工藝之一，而熱加工過程中肌肉蛋白質分子間化學作用力和結構的變化對肉制品的最終品質起著重要影響[2]。李蕙蕙[3]研究發現，在雞肉火腿腸加工過程中，隨加熱溫度的升高，雞胸肉鹽溶蛋白溶液的疏水相互作用先劇烈上升后穩步回落，加熱到80 ℃時，鹽溶蛋白中210、96.5 kDa及小分子質量蛋白的電泳帶全部消失。鄧麗等[4]研究了鮑魚熱加工過程中蛋白間作用力及其質構特性，結果發現隨溫度升高，蛋白二級結構發生明顯變化，各化學作用力與蛋白凝膠質構特性具有高度相關性。劉海梅等[5]研究發現，在鰱魚魚糜凝膠形成過程中，采用40 ℃和90 ℃兩段加熱，鰱魚肌球蛋白的α-螺旋結構部分轉變成β-轉角和無規卷曲結構，以無規卷曲結構為主，其中α-螺旋和無規卷曲結構是維持鰱魚魚糜凝膠網絡結構的主要蛋白質構象。張莉莉[6]的研究發現，隨著處理溫度（100～121 ℃）的升高，魚糜凝膠中蛋白質二級結構無規卷曲被破壞，離子鍵和疏水相互作用劇烈下降，而氫鍵和二硫鍵整體呈上升的趨勢。

國內外對肉制品在熱加工過程中蛋白質間化學作用力和結構變化的研究多集中在火腿腸、魚糜等方面，并且通常在100 ℃以下，而對牛肉高溫肉制品的研究較少。本實驗以不同高溫處理的牛背最長肌為研究對象，采用化學法并結合傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜、內源熒光光譜以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），研究高溫處理對蛋白質間化學作用力和結構的影響，以期為進一步分析高溫處理過程中牛肉蛋白質變化的機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取來自河南伊賽牛肉股份有限公司宰殺的18 月齡夏洛萊牛公牛6 頭，屠宰前禁食、禁水12 h。每頭牛經擊暈、宰殺、放血、去頭蹄內臟、剝皮、劈半、沖洗后，胴體吊掛排酸3 d，選取牛背最長肌作為樣品。

氯化鈉、尿素、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴化鉀、溴酚藍、異丙醇、乙酸、磷酸（均為分析純） 天津市德恩化學試劑有限公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylenediamine，TEMED）、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、SDS 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

FJ-200高速分散均質機 上海標本模型廠；H1650高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；DYCZ-24DN垂直電泳槽、DYY-6C型穩壓穩流型電泳儀北京市六一儀器廠；Gel-Doc-XR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TYAIB型高壓蒸汽滅菌鍋 寧波久興醫療器械有限公司；VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀德國Bruker公司；UV2600紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；Cary eclipse型熒光分光光度計 美國Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉樣品的預處理及高溫處理

生鮮牛背最長肌順著肉樣紋理將其肉眼可見的表面脂肪、夾層脂肪剔除干凈，并修整切割成大小均勻的方形肉塊（5 cm×5 cm×1 cm），用蒸煮袋真空密封包裝，隨后放入高壓蒸汽滅菌鍋中進行高溫處理。參考張莉莉[6]的方法，高溫處理條件為：高壓蒸汽滅菌鍋壓力0.12 MPa，當溫度達到（110±1）、（115±1）℃和（121±1）℃后分別保持3、6、9、12、15 min，高溫處理后的牛肉樣品靜置冷卻后放在4 ℃冰箱冷藏室待測。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照Xiong Youling L.等[7]的方法并作適當修改，準確稱取5.000 0 g處理過的肉樣，以未處理（0 min）的樣品為對照，加入10 倍體積分離緩沖液A（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸、0.5 mmol/L二硫蘇糖醇、10 mmol/L K2HPO4，pH 7.0），10 000 r/min均質1 min后80 目紗布過濾，濾液10 000 r/min冷凍離心10 min，取沉淀，重復3 次。沉淀再加入4 倍體積分離緩沖液B（0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L NaN3，pH 6.25），10 000 r/min冷凍離心10 min，棄上清液取沉淀，重復3 次，沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.3 化學作用力的測定

參考Gómez-Guillén等[8]的方法，準確稱取1 g處理后的肉樣，以未處理（0 min）的樣品為對照，分別加入10 mL 0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（SD）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/L β-巰基乙醇（SE），10 000 r/min均質1 min后于4 ℃條件下靜置2 h，然后10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液。采用Lowry法測定上清液中蛋白質的含量。離子鍵的含量以溶解于SB與SA的蛋白質含量之差表示；氫鍵的含量以溶解于SC與SB的蛋白質含量之差表示；疏水相互作用的含量以溶解于SD與SC的蛋白質含量之差表示；二硫鍵的含量以溶解于SE與SD的蛋白質含量之差表示。離子鍵的相對含量以離子鍵的含量與所有化學作用力的含量之和的比來計算，氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵相對含量的計算方法與之相同。

1.3.4 肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

準確稱取1 mg不同溫度處理的肌原纖維蛋白，以未處理（0 min）的樣品為對照，加入100 mg KBr研磨壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品在400～4 000 cm-1范圍內進行全波數掃描，儀器分辨率為5 cm-1，掃描信號累加64 次。

1.3.5 肌原纖維蛋白紫外吸收光譜分析

不同溫度處理的肌原纖維蛋白用10 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液配制成1 mg/mL的蛋白溶液，以10 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液作為空白，以未處理（0 min）的樣品為對照，進行紫外光譜掃描，掃描速率10 nm/s，掃描波長范圍200～600 nm。

1.3.6 肌原纖維蛋白內源熒光光譜分析

不同高溫處理下的肌原纖維蛋白用10 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液配制成1 mg/mL的蛋白溶液，以10 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液作為空白，以未處理（0 min）的樣品為對照，采用熒光分光光度計進行熒光光譜掃描，激發波長為295 nm，發射波長300～400 nm，掃描范圍300～500 nm，激發和發射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.7 肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

采用Laemmli[9]的電泳體系，參考姜啟興[10]的方法并做適當修改，樣品質量濃度1 mg/mL，分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為5%。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 牛肉蛋白質化學作用力的變化

由表1可見，離子鍵相對含量在加熱初期與生鮮樣品（0 min）相比顯著下降（P＜0.05），并隨著加熱時間的延長呈不斷下降的趨勢，但在加熱后期變化不顯著（P＞0.05）。在110、115 ℃和121 ℃加熱15 min后離子鍵相對含量分別下降了71.3%、88.4%和92.2%。氫鍵相對含量隨著加熱時間延長呈急劇下降的趨勢，但在加熱中期（6～9 min）變化不顯著（P＞0.05）。121 ℃加熱3 min后，氫鍵相對含量比110、115 ℃下降幅度高，達到57.8%；說明加熱溫度越高，氫鍵出現斷裂的時間點越早。結果表明隨著溫度升高，離子鍵、氫鍵發生了斷裂，相對含量減少。離子鍵和氫鍵是相對于疏水相互作用和二硫鍵較弱的鍵合力，在加熱初期就能被破壞，而在加熱后期無明顯變化[11]。

表1 不同處理溫度和時間對牛背最長肌蛋白質間化學作用力的影響Table1 Effects of temperature and heating time on chemical forces of beef longissimus dorsi muscle proteins

疏水相互作用相對含量在110、115 ℃時隨加熱時間的延長呈急劇上升的趨勢（P＜0.05），加熱15 min后分別增加了82.9%和92.1%，而在121 ℃時呈先升高后下降的趨勢。加熱過程促進了蛋白疏水性基團的暴露，促使疏水相互作用增強，而隨著熱處理溫度的升高或時間的延長，蛋白質的空間結構改變，使更多的疏水性氨基酸殘基暴露出來，增加了蛋白質表面疏水性，同時生成了復雜的結構，進而降低了疏水相互作用[12]。二硫鍵相對含量隨加熱時間的延長呈先升高后下降的趨勢（P＜0.05），且高于離子鍵和氫鍵，110、115 ℃條件下均在9 min時達到最大值（17.51%、18.46%），而在121 ℃加熱12 min時才達到最大值（28.18%）。在高溫處理過程中，隨溫度的升高或時間的延長，大量巰基暴露出來發生氧化，蛋白質之間產生交聯作用，促進了二硫鍵的形成[13]。

同一加熱時間（9 min），分析不同加熱溫度下牛肉蛋白質間化學作用力的變化，可以看出隨著處理溫度的升高，離子鍵和氫鍵相對含量不斷下降，而疏水相互作用和二硫鍵相對含量呈上升的趨勢，并在110 ℃和115 ℃時差異不明顯。而這與張莉莉[6]研究高溫（100～120 ℃）處理對魚糜凝膠蛋白質間相互作用力影響的結果一致。

2.2 牛肉肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

一般3 400～3 440 cm-1附近為酰胺A帶，反映了N—H的伸縮振動；1 664 cm-1處的特征吸收峰歸屬于酰胺I帶C＝O的伸縮振動；酰胺II帶的特征頻率在1 534 cm-1處，反映了C—N的伸縮或N—H的彎曲振動；1 244 cm-1處的酰胺III帶是由C—H的伸縮或N—H的彎曲振動產生的[14]。

圖1 不同處理溫度和時間的牛肉肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig.1 Fourier transform infrared spectra of myofibrillar protein at different temperatures and heating times

由圖1可知，與對照相比，經110、115 ℃和121 ℃高溫處理后，牛肉肌原纖維蛋白的酰胺A帶從3 285 cm-1處右移至3 280 cm-1附近，可能是酰胺A帶的N—H伸縮振動與氫鍵形成締合體，從而向低波數位移，表明氫鍵發生了變化，此結果與化學法測定氫鍵含量的結果一致[3]。與對照組相比，高溫處理后1 664 cm-1處反映α-螺旋的特征吸收峰向右偏移至1 650 cm-1附近，并隨加熱時間的延長繼續向右輕微偏移，說明加熱后牛肉肌原纖維蛋白的α-螺旋轉變為無規卷曲結構[15-16]。在1 534 cm-1附近，隨著加熱時間的延長，酰胺II帶的特征吸收峰峰形逐漸變寬，表明發生了N—H彎曲和C—N的伸縮振動。隨加熱時間的延長，1 244 cm-1處的酰胺III帶無明顯變化。同一加熱時間不同溫度下，隨著溫度的升高，酰胺A帶、酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶均向右偏移，1 664 cm-1和1 534 cm-1附近的吸收峰峰形變寬，說明肌原纖維蛋白氨基酸殘基總吸光度發生了變化，蛋白質的二級結構改變。這與鄧麗等[4]研究熱加工過程中鮑魚腹足肌原纖維蛋白紅外光譜變化的結果一致。

2.3 牛肉肌原纖維蛋白紫外吸收光譜分析

圖2 不同處理溫度和時間的牛肉肌原纖維蛋白紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet-visible spectra of myofibrillar protein at different temperatures and heating times

由于色氨酸和酪氨酸殘基側鏈基團對紫外光具有吸收作用，因此可采用紫外吸收光譜研究蛋白質三級結構的變化[17]。從圖2中可以看出，高溫處理后，表征色氨酸和酪氨酸殘基側鏈基團的275 nm波長處特征吸收峰發生了明顯的藍移，并伴隨著紫外吸收強度的增強而增強。表明高溫處理使色氨酸和酪氨酸殘基暴露于蛋白質表面，其所處的微環境由非極性向極性轉變[18]。與對照組相比，110、115 ℃和121 ℃加熱使牛肉肌原纖維蛋白紫外最大吸收峰波長（λmax）由波長275 nm藍移至259 nm處，但隨著加熱時間的延長，牛肉肌原纖維蛋白λmax無明顯偏移，這與黃友如等[19]研究高溫處理對脫脂豆粕中大豆分離蛋白結構影響的結果一致。這可能是由于加熱一定時間后，牛肉肌原纖維蛋白趨于完全變性，蛋白構象逐漸趨向穩定以適應新環境。在110、115 ℃加熱條件下，隨著加熱時間的延長，紫外吸收強度先升高后下降，并分別在9 min和12 min時達到最大值，表明肌原纖維蛋白展開，越來越多的芳香族氨基酸殘基暴露于蛋白質表面。紫外吸收強度的下降可能與高溫處理后期生色氨基酸基團發生氧化、含量減少有關[20]。溫度升至121 ℃時，紫外吸收強度隨加熱時間的延長先下降后升高并趨于穩定，表明肌原纖維蛋白二級結構中α-螺旋受到了較大程度的破壞，傅里葉變換紅外光譜分析也證實了這一點。相同加熱時間下，隨著加熱溫度的升高，牛肉肌原纖維蛋白λmax無明顯偏移，紫外吸收強度隨溫度升高而降低，峰型變窄，可能是因為蛋白經高溫處理形成聚集體，導致暴露在外部的生色氨基酸基團重新隱藏在內部，造成紫外吸收強度降低[21-22]。

2.4 牛肉肌原纖維蛋白內源熒光光譜分析

高溫處理會造成蛋白質發生變性，引起蛋白構象的改變，從而使得芳香族氨基酸殘基的位置和微環境發生變化；而芳香族氨基酸殘基可吸收紫外入射光發射熒光，因此可利用內源熒光光譜來研究蛋白質構象的變化[23]。從圖3中可以看出，高溫處理使得牛肉肌原纖維蛋白λmax明顯紅移，熒光強度不同程度的增強。在110 ℃下，牛肉肌原纖維蛋白λmax從波長332 nm紅移至349 nm附近，隨加熱時間的延長繼續紅移至波長355 nm處；熒光強度隨加熱時間的延長先增大后減小，在9 min時達到最大。這表明高溫處理使肌原纖維蛋白變性，色氨酸側鏈基團逐漸從內部疏水區向溶劑暴露，其所處的微環境極性增加，熒光強度增強[24]。溫度升至115 ℃時，牛肉肌原纖維蛋白λmax進一步紅移至波長351 nm附近，而隨著加熱時間的延長，牛肉肌原纖維蛋白λmax并沒有發生明顯的偏移；熒光強度變化趨勢與110 ℃相似，隨加熱時間的延長先增大后減小，并在12 min時達到最大。121 ℃下，λmax紅移至波長352 nm附近，并隨加熱時間延長輕微藍移至波長349 nm處直至穩定，這可能是因為121 ℃加熱后期色氨酸側鏈基團中酚氧原子孤對電子與芳環之間的激發態電荷轉移作用受到部分抑制，從而移向更為疏水的環境中。郭麗萍[25]的研究發現，隨處理溫度升高豬肉肌原纖維蛋白熒光光譜出現微小的藍移現象，與本研究結果一致。隨加熱時間的延長，熒光強度先減小后增大，并在6 min時降至最低，可能是因為蛋白色氨酸側鏈基團在加熱過程中會出現短暫的收縮，隨后逐漸舒展暴露，直至構象穩定[26-27]。同一加熱時間下，隨著加熱溫度升高，牛肉肌原纖維蛋白λmax在波長350 nm附近無明顯偏移，與紫外吸收光譜變化趨勢相似；熒光強度隨溫度升高而逐漸減弱，這與Lefevre等[28]發現大西洋鮭肌原纖維蛋白分子在加熱過程中，隨著加熱溫度的升高，內源熒光強度逐漸降低的結果一致。

圖3 不同處理溫度和時間的牛肉肌原纖維蛋白內源熒光光譜圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectra of myofibrillar protein at different temperatures and heating times

2.5 牛肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

圖4 不同處理溫度和時間的牛背最長肌肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE of myofibrillar proteins from beef longissimus dorsi muscle at different temperatures and heating times

從圖4中可以看出，隨著處理溫度的升高和加熱時間的延長，牛背最長肌中肌原纖維蛋白發生了明顯的降解聚集，形成了小分子質量的蛋白片段，從而導致了許多電泳條帶的消失以及新條帶的生成。與對照組相比，高溫處理后牛背最長肌肌原纖維蛋白的電泳條帶在200～66.4 kDa和44.3～29.0 kDa范圍內均出現了明顯的模糊變淡甚至消失現象。200 kDa處的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）條帶隨著加熱時間的延長逐漸變淡，在110 ℃加熱9 min之前無明顯變化，在115 ℃加熱6 min時突然消失，而在121 ℃加熱條件下則完全消失。Runglerdkriangkrai等[29]的研究發現，魚丸在116 ℃加熱3 min時，MHC條帶明顯變淺，加熱至6 min時則幾乎完全消失，與本研究結果基本一致。而44.3 kDa處的肌動蛋白在加熱初期發生輕微降解后，隨著加熱時間的延長無明顯變化，表明肌動蛋白的熱穩定性明顯高于肌球蛋白。Tornberg[30]的研究發現，在雞肉加熱過程中，肌動蛋白電泳條帶比肌球蛋白消失更慢，與本研究結果一致。110 ℃加熱9 min時出現了27 kDa的新條帶，可能是由于大分子蛋白在高溫下降解或者凝聚產生的。隨著處理溫度的升高和時間的延長，MHC條帶上部的顏色加深，可能是高溫使肌原纖維蛋白發生了過度聚合變性，產生了聚集現象，形成聚集體。

3 結 論

在高溫處理過程中，牛肉蛋白質離子鍵和氫鍵發生了斷裂，并隨著溫度的升高和加熱時間的延長呈不斷下降的趨勢（P＜0.05）。由于離子鍵和氫鍵是相對于疏水相互作用和二硫鍵較弱的鍵合力，在加熱初期就能被破壞，而在加熱后期則無明顯變化（P＞0.05）。同時，蛋白疏水性基團的暴露使得疏水相互作用增強，并且暴露出大量巰基發生氧化，蛋白質之間產生交聯作用，進而促進了二硫鍵的形成。牛肉肌原纖維蛋白質二級結構在高溫處理過程中發生重排，N—H和C—N伸縮振動以及N—H彎曲振動較為明顯。紫外吸收光譜和內源熒光光譜的分析結果表明，高溫處理對牛肉肌原纖維蛋白質的三級結構產生了影響，越來越多的芳香族氨基酸殘基暴露于分子表面，蛋白質疏水區域發生了局部改變。肌原纖維蛋白發生了明顯的降解聚集，并形成了大量小分子質量的蛋白片段。

肌原纖維蛋白在牛肉加工過程中起很重要的作用，肌原纖維蛋白在加熱后形成凝膠，其形成不僅與制品質構有關，而且對產品賦形及水分的保留起重要作用。隨著處理溫度的升高和加熱時間的延長，牛肉肌原纖維蛋白質結構發生了不同程度的變化。因此，實際加工過程中，要把保證產品商業無菌和提高品質有機結合，本研究條件下以121 ℃保持6～9 min為宜。