超聲預(yù)處理制備大豆分離蛋白/糖復(fù)合物及其結(jié)構(gòu)與溶解性

趙城彬，齊寶坤，張 浩，劉景圣，許秀穎，曹 勇，吳玉柱，吳 非,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）可作為一種食品添加劑應(yīng)用于食品體系中，不僅具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有乳化性、凝膠性、起泡性等多種功能特性，對(duì)食品品質(zhì)的改善具有重要作用[1]。這些功能特性均受蛋白質(zhì)溶解性的影響，良好的溶解性是大豆蛋白發(fā)揮其他功能特性的基礎(chǔ)[2]。近年來，蛋白質(zhì)糖基化改性受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)與糖之間可以通過共價(jià)鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物，共價(jià)鍵一般由糖的還原羧基與蛋白質(zhì)的活性氨基通過化學(xué)反應(yīng)形成，最終能夠得到一種酰胺化合物[3]。Wang Xibo等[4]將SPI與乳糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其功能性質(zhì)尤其是溶解性得到明顯改善。然而，采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行糖基化反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、效率低，同時(shí)產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。超聲波技術(shù)作為一種改性方法廣泛應(yīng)用于食品蛋白加工中，超聲波直接作用于食品蛋白，能夠修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，改善蛋白質(zhì)功能特性。另外，超聲波也可作為預(yù)處理手段或輔助手段促進(jìn)蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)，達(dá)到改性目的[5]。Jiang Lianzhou等[6]采用頻率為20 kHz、功率為150 W的超聲探頭對(duì)黑豆蛋白溶液處理12 min，發(fā)現(xiàn)黑豆蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，溶解性得到改善。Li Chen等[7]采用超聲法和濕熱法對(duì)花生分離蛋白與葡甘露聚糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)制備共價(jià)復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠加快蛋白質(zhì)與多糖之間的接枝反應(yīng)速率，超聲法制備的復(fù)合物具有更少的α-螺旋結(jié)構(gòu)、更多的β-結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲、較高的表面疏水性和更松散三級(jí)結(jié)構(gòu)，且溶解性和乳化性均得到改善。然而，關(guān)于超聲預(yù)處理制備SPI/糖復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)與溶解性的構(gòu)效關(guān)系及促溶機(jī)制的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)濕熱法制備的SPI/糖復(fù)合物進(jìn)行超聲預(yù)處理，采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopic，F(xiàn)TIR）和熒光光譜技術(shù)對(duì)糖基化復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)測(cè)定其溶解度，探討超聲預(yù)處理對(duì)SPI/糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)和溶解性的影響，為改善大豆蛋白溶解性以及進(jìn)一步了解超聲作用下SPI/糖復(fù)合物的促溶機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI 哈高科食品有限責(zé)任公司；葡萄糖（glucose，G）、麥芽糖（maltose，M）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇 美國(guó)Sigma公司；溴化鉀 上?；瘜W(xué)試劑公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；JY92-2D超聲探頭發(fā)生器 寧波Scientz生物科技股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；LGJ-1冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用離心機(jī)廠；DU800型紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；TNZ1-5700 FTIR儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；F2000熒光光譜儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI糖基化復(fù)合物的制備

將SPI分散到0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的SPI溶液。以SPI/糖質(zhì)量比1∶1分別向SPI溶液中添加葡萄糖和麥芽糖混合均勻，配成SPI/糖混合液。將混合液在室溫下磁力攪拌2 h，4 ℃貯藏過夜，以確保SPI完全溶解并充分與糖混勻?？刂瞥暪β蕿?00 W，室溫下分別對(duì)混合液超聲預(yù)處理5、10、20、30 min。超聲處理模式為開啟3 s、關(guān)閉1 s。超聲預(yù)處理后將混合液置于95 ℃水浴中熱處理15 min，迅速冷卻后冷凍干燥即得超聲SPI/G復(fù)合物和超聲SPI/M復(fù)合物，分別記作U-SPI/G和U-SPI/M。相同的混合液未經(jīng)超聲預(yù)處理直接進(jìn)行95 ℃水浴熱處理，隨后的處理與超聲SPI/糖復(fù)合物相同，得到非超聲SPI/G復(fù)合物和非超聲SPI/M復(fù)合物，分別記作NU-SPI/G和NU-SPI/M。

以不添加糖的SPI樣品為對(duì)照。SPI在相同的條件下經(jīng)超聲預(yù)處理后，95 ℃水浴加熱15 min的樣品為超聲SPI，記作U-SPI；SPI在相同的條件下未經(jīng)超聲預(yù)處理，直接進(jìn)行95 ℃水浴加熱15 min的樣品為非超聲SPI，記作NU-SPI；未經(jīng)任何處理的SPI為天然SPI。

1.3.2 DG測(cè)定

采用OPA試劑法測(cè)定接枝度（degree of graft，DG）。將80 mg OPA溶解在2 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液中，并與50 mL 10 mmol/L四硼酸鈉緩沖液（pH 9.7）、5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% SDS溶液以及200 μL β-巰基乙醇混合，充分混勻后用蒸餾水稀釋至100 mL，配成OPA試劑。將200 μL復(fù)合體系樣品溶液（2 mg/mL）與4 mL OPA試劑在室溫下反應(yīng)5 min，然后采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定340 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以天然SPI作為對(duì)照樣品，DG的計(jì)算公式如下。

式中：Ac為對(duì)照樣品的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.3 褐變強(qiáng)度測(cè)定

根據(jù)Abdelhedi等[8]的方法測(cè)定褐變強(qiáng)度。將待測(cè)樣品采用去離子水稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，空白樣品為去離子水。采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處的吸光度A420nm以表示褐變強(qiáng)度。

1.3.4 FTIR測(cè)定

參照趙城彬等[9]的方法測(cè)定FTIR圖譜，將蛋白樣品與溴化鉀研磨成均勻粉末，壓片后置于FTIR儀中測(cè)定。FTIR儀的測(cè)定溫度為25 ℃，波數(shù)掃描范圍為500～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，掃描次數(shù)為64 次。采用Peak Fit 4.12 FTIR圖譜分析軟件對(duì)樣品的酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）進(jìn)行分析，計(jì)算蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.5 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

蛋白樣品的內(nèi)源熒光光譜根據(jù)Zhao Chengbin等[10]的方法測(cè)定。采用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制1.5 mg/mL蛋白溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～450 nm，狹縫寬度為5 nm的條件下，通過F2000熒光光譜儀測(cè)定樣品的內(nèi)源熒光光譜。

1.3.6 溶解度測(cè)定

將樣品溶于去離子水中，配成蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。采用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至2、3、4、4.5、5、6、7、8、9，在12 000×g下離心30 min。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)物，采用Lowry法測(cè)定上清液中可溶性蛋白含量。蛋白質(zhì)溶解度以上清液可溶性蛋白含量占總蛋白含量的比例表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS V17.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲預(yù)處理時(shí)間的確定

圖1 SPI與葡萄糖和麥芽糖糖基化復(fù)合物DG隨超聲時(shí)間的變化Fig.1 The changes in the degree of graft for glycoconjugates of SPI with glucose and maltose as ultrasound time

如圖1所示，無論是否進(jìn)行超聲預(yù)處理，在相同處理?xiàng)l件下，SPI/G復(fù)合物的DG均顯著高于SPI/M復(fù)合物（P＜0.05），這表明SPI更容易與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)。根據(jù)Chevalier等[11]的報(bào)道，糖基化反應(yīng)速率與參加反應(yīng)的還原糖分子質(zhì)量大小有關(guān)，單糖比雙糖具有更高的反應(yīng)活性，這也是SPI/G復(fù)合物的DG高于SPI/M復(fù)合物的原因。超聲預(yù)處理制備的SPI/糖復(fù)合物DG比未經(jīng)超聲預(yù)處理制備的SPI/糖復(fù)合物高，這表明超聲處理后的糖基化反應(yīng)速率比未經(jīng)超聲處理更快。原因很可能是由于超聲處理過程中蛋白質(zhì)肽鏈展開，利于反應(yīng)基團(tuán)的相互靠近[12]，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)與糖之間的糖基化反應(yīng)。此外，超聲預(yù)處理20 min時(shí)DG達(dá)到最大，而超過20 min后DG稍有降低，這可能是由于過長(zhǎng)的超聲處理時(shí)間會(huì)使蛋白質(zhì)展開的肽鏈重新聚集，不利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行[13]。因此，采用超聲預(yù)處理時(shí)間為20 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 SPI糖基化復(fù)合物褐變強(qiáng)度分析

圖2 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物的褐變強(qiáng)度Fig.2 Browning intensity of SPI and SPI-sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

褐變強(qiáng)度能夠表征糖基化反應(yīng)的高級(jí)階段，是糖基化反應(yīng)進(jìn)程的指示器[14]。如圖2所示，與天然SPI相比，對(duì)SPI進(jìn)行熱處理不會(huì)導(dǎo)致A420nm的增加。然而，SPI/糖復(fù)合物的A420nm明顯增加。SPI與糖（葡萄糖和麥芽糖）加熱后，由于發(fā)色團(tuán)的形成[15]，出現(xiàn)了褐變，這表明SPI與糖發(fā)生了糖基化反應(yīng)。與SPI/G復(fù)合物相比，SPI/M復(fù)合物的褐變強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05）。這很可能是由于糖基化反應(yīng)過程中雙糖形成的酸比單糖多，導(dǎo)致體系pH值下降，從而加快糖基化反應(yīng)進(jìn)程，這與Li Yue等[16]對(duì)大米蛋白糖基化反應(yīng)的研究結(jié)果相似。此外，Wang Heya等[17]的研究表明，褐色產(chǎn)物（類黑精）是通過中間產(chǎn)物聚合形成的。超聲預(yù)處理能夠降低SPI/糖復(fù)合物的A420nm，這可能是由于超聲預(yù)處理通過抑制糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物的聚合而阻礙褐色產(chǎn)物的形成。盡管超聲SPI/糖復(fù)合物具有較高的DG（圖1），但是超聲預(yù)處理還是會(huì)降低SPI/糖復(fù)合物的褐變強(qiáng)度，這一結(jié)果表明超聲預(yù)處理能夠制備高DG且低褐變的SPI/糖復(fù)合物。

2.3 SPI糖基化復(fù)合物FTIR分析

圖3 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI（A）和SPI/糖復(fù)合物（B）的FTIR圖譜Fig.3 FTIR spectra of SPI (A) and SPI-sugar conjugates (B) with and without ultrasonic pretreatment

FTIR技術(shù)作為大分子物質(zhì)分析的有效手段，通過分子內(nèi)原子振動(dòng)產(chǎn)生的能量吸收，廣泛應(yīng)用于食物的組分、大分子聚合物的化學(xué)組成以及蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析等方面[18]。由圖3A可以看出，無論是否進(jìn)行超聲預(yù)處理，在不添加糖的情況下，熱處理SPI的FTIR吸收峰的變化趨勢(shì)及峰形與天然SPI相似。熱處理能夠使SPI在1 658 cm-1（酰胺I帶）和1 542 cm-1（酰胺II帶）處的吸收峰強(qiáng)度明顯增加，這分別是由蛋白質(zhì)肽鏈中C＝O伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的[19]。

由圖3B可以看出，糖基化作用使SPI的FTIR圖譜發(fā)生顯著改變。與天然SPI相比，SPI/糖復(fù)合物在3 314 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)寬峰且吸收強(qiáng)度增大，這是由于游離—OH的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[20]。這表明SPI發(fā)生糖基化反應(yīng)后，糖分子以共價(jià)鍵形式接入SPI中，使—OH的數(shù)量增多。與SPI/G復(fù)合物相比，SPI/M復(fù)合物在3 314 cm-1處具有更強(qiáng)的吸收峰，這可能是由于麥芽糖由兩個(gè)葡萄糖分子構(gòu)成，具有更多的—OH，導(dǎo)致此處吸收峰更強(qiáng)。在1 077 cm-1處，天然SPI幾乎沒有吸收峰，而SPI/糖復(fù)合物具有很強(qiáng)的吸收峰，這是由糖分子中C—O—C糖苷鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[21]，表明糖分子與SPI發(fā)生了糖基化反應(yīng)，引入了相應(yīng)的功能性基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白分子側(cè)鏈振動(dòng)，并產(chǎn)生了相應(yīng)的吸收峰。SPI/M復(fù)合物在1 077 cm-1處的吸收峰比SPI/G復(fù)合物強(qiáng)，這是由于麥芽糖比葡萄糖具有更多能夠在此處產(chǎn)生吸收峰的基團(tuán)。與天然SPI相比，在1 658 cm-1（酰胺I帶）、1 542 cm-1（酰胺II帶）和1 405 cm-1（酰胺III帶）處，SPI/糖復(fù)合物的吸收峰增強(qiáng)，SPI/M復(fù)合物具有比SPI/G復(fù)合物更強(qiáng)的吸收峰。Gu Fenglin等[22]在對(duì)酪蛋白與葡萄糖美拉德反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，美拉德產(chǎn)物（如糖胺化合物、席夫堿和吡嗪類化合物）含量升高會(huì)使酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶處的吸收峰增強(qiáng)。酰胺I～I(xiàn)II帶處的吸收峰強(qiáng)度的變化表明糖基化反應(yīng)的發(fā)生。此外，SPI/糖復(fù)合物在2 931 cm-1處的吸收變強(qiáng)，這是由糖分子中—CH3和—CH2基團(tuán)中C—H的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[23]，進(jìn)一步證實(shí)了糖分子與SPI形成了共價(jià)復(fù)合物。超聲預(yù)處理不會(huì)改變SPI/糖復(fù)合物FTIR的吸收峰。以上分析可以得出，SPI與糖分子之間發(fā)生了復(fù)雜的交聯(lián)和聚合作用，形成了SPI/糖復(fù)合物。

利用波段縮小技術(shù)將蛋白質(zhì)FTIR酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）細(xì)分，采用二階導(dǎo)數(shù)紅外去卷積光譜擬合法對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。確定擬合圖譜中各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)類型的對(duì)應(yīng)關(guān)系：1 610～1 640 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)；1 640～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 660～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[24]。通過計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的峰面積與酰胺I帶總峰面積之比，得到α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲含量，結(jié)果見表1。

表1 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table1 Secondary structure content of SPI and SPI-sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment

由表1可以看出，天然SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋和無規(guī)卷曲含量相對(duì)較少，主要以β-結(jié)構(gòu)為主。對(duì)SPI進(jìn)行熱處理后，α-螺旋和β-折疊含量顯著降低（P＜0.05），而無規(guī)卷曲含量顯著增加（P＜0.05），這表明熱處理會(huì)使SPI分子結(jié)構(gòu)由有序變?yōu)闊o序，可能是由于蛋白分子發(fā)生熱變性使其結(jié)構(gòu)展開，破壞了原來的有序結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無序結(jié)構(gòu)含量增加[25]。此外，超聲預(yù)處理會(huì)使熱處理過程中蛋白分子結(jié)構(gòu)變得更加無序，結(jié)構(gòu)展開的更加充分，暴露出更多的活性基團(tuán)，改善了蛋白分子的柔韌性[26]，這也可能是超聲能夠促進(jìn)糖基化反應(yīng)的原因。與熱處理SPI相比，SPI/糖復(fù)合物α-螺旋含量的增加和無規(guī)卷曲含量的降低說明糖基化反應(yīng)會(huì)減少熱處理過程中SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序向無序的轉(zhuǎn)變程度，這可能是由于SPI與糖共價(jià)復(fù)合抑制了蛋白質(zhì)熱變性而導(dǎo)致的[27]。SPI/G復(fù)合物結(jié)構(gòu)比SPI/M復(fù)合物更加有序，說明葡萄糖比麥芽糖具有更強(qiáng)的抑制蛋白質(zhì)熱變性作用，這可能與兩種糖DG的不同有關(guān)（圖1）。此外，盡管超聲預(yù)處理會(huì)使熱處理蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變的更加無序，但超聲作用對(duì)于SPI/糖復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響并不顯著（P＞0.05）。Li Chen等[28]發(fā)現(xiàn)在80 ℃超聲處理下，花生分離蛋白與葡聚糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后生成的復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，與本研究結(jié)果有所不同，這可能是由于大分子多糖和小分子糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同而導(dǎo)致的。

2.4 SPI糖基化復(fù)合物內(nèi)源熒光光譜分析

圖4 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI（A）和SPI/糖復(fù)合物（B）的內(nèi)源熒光光譜Fig.4 Intrinsic fluorescence spectra of SPI (A) and SPI-sugar conjugates (B) with and without ultrasonic pretreatment

內(nèi)源熒光光譜用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)色氨酸（Trp）殘基周圍的構(gòu)象變化，表征蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)[29]。由圖4A可知，與天然SPI相比，無論是否采用超聲預(yù)處理，熱處理均能夠增加SPI的熒光強(qiáng)度，這可能是由于熱處理過程中蛋白質(zhì)變性引起Trp殘基周圍結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的[30]。超聲SPI的熒光強(qiáng)度高于非超聲SPI，這表明超聲預(yù)處理能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)熱變性，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改變。此外，非超聲SPI和超聲SPI的熒光發(fā)射最大波長(zhǎng)（λmax）均比天然SPI高，表明λmax發(fā)生了紅移。與非超聲SPI相比，超聲SPI的λmax紅移程度更大，這表明超聲預(yù)處理能夠促進(jìn)SPI的構(gòu)象變化。

由圖4B可知，SPI/糖復(fù)合物的熒光強(qiáng)度相比于天然SPI明顯增加。Jing Hao等[31]對(duì)酪蛋白-糖美拉德產(chǎn)物理化性質(zhì)的研究表明，熒光復(fù)合物的增加可能與熱誘導(dǎo)糖基化反應(yīng)有關(guān)。超聲預(yù)處理能夠使SPI/糖復(fù)合物的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增加，這表明超聲作用促進(jìn)了熒光復(fù)合物的生成。與SPI/M復(fù)合物相比，SPI/G復(fù)合物具有更高的熒光強(qiáng)度，這與不同糖復(fù)合物的光譜學(xué)性質(zhì)和熒光化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)[32]，該結(jié)果與β-乳球蛋白糖基化復(fù)合物的研究結(jié)果相似[33]。此外，所有SPI/糖復(fù)合物的λmax均發(fā)生紅移。SPI/糖復(fù)合物λmax的紅移表明糖基化會(huì)改變SPI的構(gòu)象，同時(shí)使SPI三級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散。與非超聲SPI/糖復(fù)合物相比，超聲預(yù)處理制備的SPI/糖復(fù)合物具有更松散的三級(jí)結(jié)構(gòu)，這與Perusko等[34]對(duì)乳清蛋白/阿拉伯糖復(fù)合物的研究結(jié)果相似。

2.5 SPI糖基化復(fù)合物溶解性分析

圖5 非超聲和超聲預(yù)處理下SPI和SPI/糖復(fù)合物溶解度隨pH值的變化Fig.5 Changes in solubility of SPI and SPI-sugar conjugates with and without ultrasonic pretreatment as a function of pH

如圖5所示，天然SPI在pH 4.5時(shí)的溶解度最低，這說明SPI的等電點(diǎn)在pH 4.5附近。對(duì)SPI進(jìn)行熱處理會(huì)降低蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近的溶解性，但會(huì)增加遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)處的溶解性。在對(duì)SPI加熱前進(jìn)行超聲預(yù)處理會(huì)明顯增加SPI溶解性，這可能是由于超聲作用改變了SPI結(jié)構(gòu)，使蛋白分子內(nèi)部的氨基酸殘基暴露出來，增加了蛋白質(zhì)表面電荷，通過靜電排斥作用降低了蛋白質(zhì)的聚集，從而改善其溶解性[35]。當(dāng)SPI與葡萄糖或麥芽糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后溶解度顯著增加（P＜0.05），尤其是在等電點(diǎn)附近。這是由于糖分子中親水性羥基的引入增加了蛋白質(zhì)與水分子之間的親和力，同時(shí)降低由蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用引起的聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性增加[36]。SPI/M復(fù)合物比SPI/G復(fù)合物溶解性高，這是由于麥芽糖分子具有更多的親水性羥基。超聲預(yù)處理會(huì)明顯增加SPI/糖復(fù)合物的溶解性，這可能與超聲預(yù)處理提高SPI/糖復(fù)合物的DG有關(guān)（圖1）。Qu Wenjuan等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，超聲作用能夠提高菜籽分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物的DG，導(dǎo)致其溶解性得到改善，與本研究結(jié)果一致。此外，雖然超聲作用對(duì)SPI/糖復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響并不顯著（表1），但能使復(fù)合物三級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加松散（圖4），這可能是改善蛋白質(zhì)溶解性的主要原因。無論是否進(jìn)行超聲預(yù)處理，SPI/糖復(fù)合物的等電點(diǎn)都會(huì)向酸性方向偏移，這可能是由于糖基化反應(yīng)會(huì)消耗帶正電的游離氨基，從而減少蛋白質(zhì)表面的正電荷[38]。

3 結(jié) 論

將SPI分別與葡萄糖和麥芽糖發(fā)生糖基化反應(yīng)。DG與褐變強(qiáng)度的分析表明，與麥芽糖相比，SPI更容易與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，超聲預(yù)處理20 min時(shí)，SPI/糖復(fù)合物的DG最大，且超聲預(yù)處理制備的SPI/糖復(fù)合物具有較低的褐變強(qiáng)度。FTIR分析表明SPI與糖分子形成了SPI/糖復(fù)合物。對(duì)酰胺I帶擬合后得到蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，糖基化反應(yīng)會(huì)減少熱處理過程中SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序向無序的轉(zhuǎn)變程度，超聲預(yù)處理對(duì)SPI/糖復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響并不顯著。內(nèi)源熒光光譜分析表明糖基化作用會(huì)使SPI的λmax發(fā)生紅移，導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散，超聲預(yù)處理能夠增加SPI/糖復(fù)合物λmax的紅移程度。溶解性分析表明糖基化反應(yīng)能夠提高SPI溶解性，尤其是在等電點(diǎn)附近。超聲預(yù)處理會(huì)增加SPI/糖復(fù)合物的溶解性，這可能與較高的DG有關(guān)。此外，超聲預(yù)處理使SPI/糖復(fù)合物三級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散也可能是其改善蛋白質(zhì)溶解性的原因。