整合低溫乳化香腸加工過程交叉污染的單增李斯特菌定量風險評估

江榮花，杜建萍，崔 旸，張春艷，劉陽泰，朱江輝，王 翔，劉 箐，董慶利,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.北京市食品安全監控和風險評估中心，北京 100053；3.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

食源性致病菌的交叉污染是指制作表面污染致病菌的食品時操作不當污染到其他食品。按照傳統的烹飪習慣，正常的加工條件（加熱一定時間）可保證食品商業無菌[1]，但部分食品在加工、運輸和銷售過程中，易被食源性致病菌污染[2]。

近年來，食源性致病菌污染引起的食品安全事故頻發，其中采用風險評估手段評估食品風險是世界公認的方法之一[3]。根據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）2014年調查表明，2013—2014年期間，交叉污染是導致食源性疾病暴發的首要原因[4]。2013—2015年期間，國家衛生和計劃生育委員會對我國食物中毒事件的監測結果表明，交叉污染是導致微生物性食物中毒人數最多的主要原因之一[5]。因此，為降低食源性疾病的暴發水平，整合交叉污染的風險評估工作迫在眉睫。

低溫乳化香腸是以畜禽肉為主要原料，加入適當輔料經斬拌、灌裝、蒸煮和巴氏殺菌等加工工藝，中心溫度達到75～85 ℃并保持一定時間而制成的產品。其中，斬拌和灌裝過程的交叉污染現象尤為嚴重[6]。同時，低溫乳化香腸中污染主要來源于原料肉和食品介質表面的間接接觸所造成的單增李斯特菌交叉污染[2]。

單增李斯特菌是人畜共患的食源性致病菌之一，可引起腦組織和血液感染。單增李斯特菌廣泛存在于環境中，如養殖場周圍的水源和土壤中，通過食物鏈導致畜禽感染，從而導致原料肉污染[7]。另外，在低溫乳化香腸的加工、運輸和貯藏過程中也可造成單增李斯特菌的污染[8]。根據WHO 2006年調查表明，單增李斯特菌污染低溫乳化香腸的概率高達10%以上[9]，較易引起相關的食源性疾病。因此，對低溫乳化香腸進行單增李斯特菌的定量風險評估刻不容緩。

風險評估的核心內容是暴露評估，微生物定量暴露評估是對通過食物攝入或其他相關途徑暴露于人體或環境中的食源性致病菌的定量評估[10]。基于定量暴露評估的結果，結合劑量效應模型（dose-response，DRM）可對人群發病率進行描述。目前已有部分香腸中食源性致病菌的風險評估研究，Gonzales-Barron等[11]對鮮肉香腸中鼠傷寒沙門氏菌進行定量風險評估研究，結果表明，低溫貯藏過程中，10萬 包香腸中約有83 包中沙門氏菌濃度高于103CFU/g，存在食用風險。相似的研究見于Syne[12]及Al-Nabulsi[13]等的研究中。因缺乏監測和單增李斯特菌的統計數據，目前香腸中單增李斯特菌的風險評估研究多為定性或半定量的風險評估。國家食品安全風險評估中心曾于2014—2015年開展了即食食品（包括香腸）中單增李斯特菌初步的定量風險評估（結果未公開）[14]。有研究表明，香腸加工過程中，絞肉和斬拌后，單增李斯特菌的檢出率分別為24.2%及20.8%[15]。以上研究僅包括了部分加工過程，且未涉及加工過程的單增李斯特菌交叉污染，因此，整合交叉污染的香腸加工過程中單增李斯特菌的定量風險評估急待明確。

本實驗模擬香腸斬拌和灌裝過程中的常見場景，測定單增李斯特菌在肉樣、斬拌機和灌腸機之間的轉移率，進而基于斬拌和灌裝過程的交叉污染結果構建香腸加工過程中單增李斯特菌的暴露評估模型，并從方法論的角度，應用指數模型、Beta-Poisson模型、Weibull-Gamma模型和Log-Logistic模型等常見劑量效應模型擬合和比較健康人群和易感人群食用污染香腸后的發病率大小，選擇最優的劑量效應模型，為香腸加工過程單增李斯特菌完整的風險評估研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

瘦肉選用去骨去皮的精腿肉，肥肉選用豬脊膘，輔料選用食鹽、亞硝酸鈉、復合磷酸鹽、大豆分離蛋白和淀粉，具體配方[16]見表1。以上材料均購于上海卜蜂蓮花超市。

表1 低溫乳化香腸的基本配方Table1 Formulation of low-temperature emulsified sausages

胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（trypticase soy-yeast extract broth，TSB-YE）培養基、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（trypticase soy-yeast extract agar，TSA-YE）培養基、單增李斯特菌選擇性培養基（Palcam瓊脂培養基）青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HLQ-8型斬拌機 安徽華菱西廚裝備股份有限公司；MLG-7型灌腸機 山東麥苗廚具有限公司；YP405N型電子天平 上海精密儀器儀表有限公司；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司；BCM-239D型無菌操作臺 江蘇蘇州安泰空氣技術有限公司；Scientz-09型無菌均質器 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株選用和菌懸液制備

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 13932血清型4b）保存于（4.0±0.5）℃的TSA-YE培養基上備用。用無菌接種環從TSA-YE培養基上挑取一環菌苔，接種于100 mL的TSB-YE培養基中，放置于37 ℃、180 r/min的搖床上培養（16±1）h至菌體濃度達到穩定期（109CFU/mL），制得初始菌懸液。用無菌生理鹽水（質量分數0.85% NaCl溶液）稀釋初始菌懸液，得到108CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 介質接種與場景設計

模擬香腸加工過程，分別將250 g瘦肉和100 g肥肉切至約25 g/塊肉樣，肉樣置于80 ℃熱水中滅菌20 s。于無菌操作臺內將肉樣用無菌鑷子夾入無菌均質袋中，并加入食鹽，置于（4.0±0.5）℃冰箱中腌制24 h。

腌制后肉樣置于潔凈器皿表面，移液槍分別移取1 mL上述菌懸液（108CFU/mL）于每塊肉樣表面，無菌鉗翻動肉樣數次，靜置15 min。將靜置后的肉樣置于斬拌機內，并加入輔料斬拌6 min。

斬拌后肉糜置于灌腸機內進行灌裝，制得半成品，每組實驗重復5 次。肉糜和半成品的帶菌量根據GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[17]進行定量測定，使用擦拭取樣法測定斬拌機的斬刀和斬鍋表面以及灌腸機的料桶和料斗表面的單增李斯特菌。

1.3.3 轉移率測定

轉移率（transfer rate，TR）是一個細菌從供體表面通過相互接觸轉移到受體表面的概率[18]，計算公式如下。

式中：Nd為細菌供體表面帶菌量（lg（CFU/g））；Nr為細菌受體表面帶菌量（lg（CFU/g））。

1.4 數據統計分析

應用Microsoft Excel 2010進行數據統計，基于蒙特卡洛模擬和卡方分析，用@Risk5.5軟件擬合轉移率和肉樣中單增李斯特菌菌量的最優分布。

1.5 低溫乳化香腸加工過程中的暴露評估模型

圖1 低溫乳化香腸加工過程的暴露評估模型Fig.1 Exposure assessment model for low-temperature emulsified sausage processing

表2 低溫乳化香腸加工過程的暴露評估模型參數設置Table2 Parameter settings of exposure assessment model for chilledemulsified sausage processing

續表2

單增李斯特菌從原料肉至香腸成品整個加工階段的暴露評估模型如圖1所示。暴露評估模型參數設置見表2，污染數據的陽性率一般符合Beta（α1，α2）分布，形狀參數α1和α2對應的公式一般為：α1＝S+1，α2＝n-S+1，其中n是取樣數，S是陽性檢出數。應用@Risk5.5軟件分別得到Pp和Pn，進而用離散型分布Discrete（1，0，Pp，Pn）描述Pc。Discrete（1，0，Pp，Pn）中，假定參數1是生鮮肉中污染單增李斯特菌的情況，對應Pp；參數0是生鮮肉中未污染單增李斯特菌的情況，對應Pn。

應用@Risk5.5軟件分別對斬拌和灌裝過程中實驗數據進行處理，擬合出轉移率和各介質表面單增李斯特菌濃度的最優分布。

烘烤過程中，參照文獻[21-23]，應用@Risk5.5軟件得出烘烤溫度和烘烤時間的分布。香腸中單增李斯特菌的一級失活模型采用線性模型，進而用Origin 9.0軟件擬合出烘烤過程的二級失活模型。貯藏過程中，參照ComBase數據庫和文獻[25]，用@Risk5.5軟件得出貯藏溫度和貯藏時間的分布。香腸中單增李斯特菌的一級生長模型采用Baranyi模型。考慮貯藏溫度對香腸中單增李斯特菌生長的影響，采用Gamma分布進行描述。

消費過程中，發病風險區分2 類人群，分別為健康人群和易感人群，健康人群包括成年人，易感人群包括嬰幼兒、老年人和孕婦。基于蒙特卡洛抽樣方法，發病風險采用指數、Beta-Poisson、Weibull-Gamma和Log-Logistic 4 種劑量效應模型[34]對健康人群和易感人群的發病率進行描述，進而用@Risk5.5軟件對發病率進行最佳分布擬合，并根據卡方檢驗結果選擇最適分布。

2 結果與分析

2.1 斬拌和灌裝過程中單增李斯特菌的轉移率

圖2 斬拌和灌裝過程中單增李斯特菌在不同介質表面間的轉移率Fig.2 Transfer rates of L. monocytogenes between different contact surfaces during chopping and stuffing

如圖2所示，斬拌場景中，TRmc和TRce有顯著性差異（P＜0.05），同時，TRmp和TRpe有顯著性差異（P＜0.05）。灌裝場景中，TReb和TRbs有顯著性差異（P＜0.05），同時，TReh和TRhs有顯著性差異（P＜0.05）。綜上，斬拌和灌裝兩種場景下，單增李斯特菌由設備至肉樣的轉移量顯著低于由肉樣至設備的轉移量（數據未列出），肉樣至設備的轉移率和設備至肉樣的轉移率均有顯著性差異，單增李斯特菌由設備至肉樣的轉移率顯著高于由肉樣至設備的轉移率。

2.2 健康人群和易感人群食用污染香腸的發病率

圖3 健康人群食用污染香腸的發病率Fig.3 Morbidity of healthy populations after consumption of contaminated sausages

根據香腸加工過程中暴露評估模型參數設置（表2），應用不同劑量效應模型擬合消費者食用污染香腸的發病率，采用@Risk5.5軟件分別進行10 000 次蒙特卡洛模擬，結果如圖3、4所示。圖3展現了健康人群因食用污染單增李斯特菌的香腸而導致發病的概率。健康人群對病原微生物的入侵具有一定抵抗力，因此相對于易感人群，低劑量下（0～3（lg（CFU/g））健康人群的發病率較低。由圖3可知，以Weibull-Gamma模型為例，當不考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染情況時，健康人群的攝入劑量為1.37（lg（CFU/g）），對應的發病率為3%；但考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染時，健康人群的攝入劑量為7.46（lg（CFU/g）），對應的發病率為36%，說明考慮交叉污染對健康人群食用污染香腸的風險描述有顯著影響。以健康人群每餐攝入劑量為6（lg（CFU/g））時為例，Weibull-Gamma模型預測的發病率（30%）顯著高于指數模型（0）、Beta-Poisson模型（10%）和Log-Logistic模型（0）的預測結果。基于風險評估研究一般從高估風險的角度，對比其他3 類模型，采用Weibull-Gamma模型預測健康人群食用污染香腸的發病率結果最大，風險最高，擬合效果最好，因此建議選擇Weibull-Gamma模型進行健康人群發病率預測。

圖4 易感人群食用污染香腸的發病率Fig.4 Morbidity of susceptible populations after consumption of contaminated sausages

圖4 反映了易感人群因食用污染單增李斯特菌的香腸而導致發病的概率。對比圖3中健康人群發病率結果，4 類模型預測易感人群發病率結果均有顯著提高。由圖4可知，以Weibull-Gamma模型為例，當不考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染情況時，易感人群的攝入劑量為1.20（lg（CFU/g）），對應的發病率為3%；但考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染時，易感人群的攝入劑量為7.30（lg（CFU/g）），對應的發病率為39%，說明考慮交叉污染對易感人群食用污染香腸的風險描述有顯著影響。以易感人群每餐攝入劑量為6（lg（CFU/g））時為例，對比其他3 類模型，Weibull-Gamma模型預測發病率的結果（35%）顯著高于指數模型（0）、Beta-Poisson模型（14%）和Log-Logistic模型（4%）的預測結果，因此建議選擇Weibull-Gamma模型進行易感人群發病率預測。

2.3 發病率的概率分布擬合

應用Weibull-Gamma模型預測健康人群和易感人群食用污染香腸后發病率的概率分布擬合如圖5、6所示，經最佳分布擬合，Logistic（0.42，0.08）和Logistic（0.46，0.08）可分別對健康人群和易感人群的發病率進行較好描述。健康人群食用污染香腸后的發病率從8%（5%置信水平）至59%（95%置信水平），易感人群食用污染香腸后的發病率從10%（5%置信水平）至62%（95%置信水平）。

圖5 健康人群食用污染香腸發病率的概率分布擬合Fig.5 Probability distribution fitting of morbidity of healthy populations after consumption of contaminated sausages

圖6 易感人群食用污染香腸發病率的概率分布擬合Fig.6 Probability distribution fitting of morbidity of susceptible populations after consumption of contaminated sausages

3 討 論

3.1 不同轉移方向下單增李斯特菌轉移率差異的分析

影響致病菌轉移的因素可劃分為兩類：環境因素和內在因素。環境因素主要涉及材料表面的物理特征，包括濕度、壓力、粗糙度和接觸時間等；內在因素主要涉及菌種，包括胞外多糖的生產能力、菌膜形成能力和有無細胞外基質結構等[36-38]。

介質表面粗糙度和濕度是影響本實驗轉移率結果的主要原因。本研究表明，單增李斯特菌由設備至肉樣的轉移率顯著高于由肉樣至設備的轉移率，光滑的設備表面更易促進單增李斯特菌的轉移。Ravishankar等[39]研究切割生菜過程中沙門氏菌的轉移情況，結果表明，對比沙門氏菌從生菜至無菌刀片的轉移情況，沙門氏菌從刀片至無菌生菜的轉移率更高。因此，介質表面粗糙度會影響致病菌的轉移，相似的研究見于Lundén[40]和Midelet[41]等的研究中。另外，表面濕度亦會影響致病菌的轉移[42]，微生物易吸附于潮濕的介質表面，因此含有較高水分的肉樣更適應于單增李斯特菌的吸附，從而限制單增李斯特菌向設備的轉移能力。綜上，介質表面的粗糙度和濕度會影響致病菌的轉移能力。

3.2 整合交叉污染的風險評估研究對人群發病率的影響

風險評估由4 部分內容組成：危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述[43]。本實驗側重描述低溫乳化香腸加工過程的暴露評估和風險特征描述。本研究表明，對比未考慮交叉污染的人群發病率結果，整合交叉污染的人群發病率結果明顯提高。日常加工操作中，設備清洗不當或操作人員衛生不合格均會造成致病菌的交叉污染。已有大量研究表明香腸加工過程中，斬拌、灌裝和包裝等過程均有致病菌交叉污染現象，且斬拌和灌裝過程的交叉污染尤為嚴重[6]。有研究顯示香腸加工過程中，沙門氏菌在不同介質間轉移率顯著，但這些研究主要側重于香腸加工過程中某一環節沙門氏菌的交叉污染情況[44-46]。而單增李斯特菌廣泛存在于香腸加工環境中，且可在香腸貯藏環境中生長。關于香腸加工過程中單增李斯特菌交叉污染的研究可為香腸加工過程中完整的風險評估研究提供借鑒。

3.3 劑量效應模型的比較和選擇

劑量效應模型主要包括單參數模型、雙參數模型和三參數模型。指數模型是單參數劑量效應模型，擬合過程較易但一般不能充分擬合劑量效應數據；Beta-Poisson模型是迄今已刊研究中模擬劑量效應關系最久的雙參數劑量效應模型[47]，已廣泛應用于微生物定量風險評估研究中，但Marks等[48]質疑了Beta-Poisson模型的充分性；Log-Logistic模型是雙參數劑量效應模型，對低劑量下的效應關系具有良好的擬合性[49]；據有限文獻調研表明，Weibull-Gamma模型是文獻中記載最多的三參數劑量效應模型[50]，當三參數中某參數為1時，Weibull-Gamma模型可以轉化為Beta-Poisson模型或Log-Logistic模型，對比雙參數劑量效應模型，三參數劑量效應模型的擬合效果更優，但擬合過程一般很難獲得三參數劑量效應模型所需不少于4 個劑量水平的數據。

本研究中對比指數模型、Beta-Poisson模型和Log-Logistic模型的擬合結果，Weibull-Gamma模型預測消費者食用污染香腸的發病率結果最大，風險最高，擬合效果最好，基于風險評估研究一般從高估風險的角度，因此建議選用Weibull-Gamma模型作為低溫乳化香腸中單增李斯特菌的最優劑量效應模型。Moon等[51]基于志愿者暴露于致病菌下感染和患病的數據，對比和評估了4 種雙參數劑量效應模型和4 種三參數劑量效應模型的擬合效果，結果表明，Weibull-Gamma模型對觀測數據的擬合效果最優。董慶利等[52]基于2001—2011年我國米飯中蠟樣芽孢桿菌導致食物中毒的數據，構建了米飯中蠟樣芽孢桿菌的劑量效應模型，數學檢驗結果表明，Weibull-Gamma模型的擬合效果明顯優于其他模型。關于香腸中單增李斯特菌劑量效應模型的選用可為控制香腸加工過程中單增李斯特菌的交叉污染提供借鑒。

4 結 論

本實驗研究了低溫乳化香腸加工過程中斬拌和灌裝過程單增李斯特菌的交叉污染情況。結果表明：單增李斯特菌由設備至肉樣的轉移率顯著高于由肉樣至設備的轉移率。構建了低溫乳化香腸加工過程中的暴露評估模型，比較了4 種劑量效應模型下健康人群和易感人群的發病率，建議選擇Weibull-Gamma模型進行消費者食用污染香腸的發病率預測。同時研究了交叉污染對低溫乳化香腸加工過程中風險評估的影響，結果表明：整合交叉污染的風險評估研究結果中消費者的發病率顯著提高。