復合菌-荔枝多酚對腹瀉小鼠腸道形態結構和腸道菌群的影響

張軍麗，涂 杜，彭新宇，黃 婷，袁明貴，徐志宏*

（1.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東 廣州 510000；2.廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510000；3.廣東省獸醫公共衛生公共實驗室，廣東 廣州 510000）

腸道微生物是被忽視的“微生物器官”[1]，越來越多的研究發現，腸道微生態失調與人類的健康有著或多或少的關系，除了與人體的消化有關之外，還與腸道疾病有著聯系[2-5]。

腸道菌群存在著一種平衡，一旦這種平衡被疾病打破之后，可以用微生態制劑治療恢復腸道菌群的平衡，或者使用藥物輔助治療。益生菌不僅可提高機體免疫力[6]，且能產生確切具有健康功效的次級代謝產物，從而改善宿主微生態的平衡、發揮有益作用，還可以維持腸道內環境穩態、拮抗腸道致病菌、重建失調的腸道菌群、遏制毒性因子對腸道的損害、保證腸道營養代謝等[7-10]，中藥與腸道菌群相互作用的研究已經起步，并越來越得到眾多中醫藥學者的關注。中藥可直接調整腸道菌群結構進而影響健康，同時腸道菌群也會通過影響口服中藥在體內的吸收代謝轉化等而改變中藥療效的發揮[11-13]。有研究發現，多酚以及其被腸道菌群代謝的產物，能選擇性調節腸道中易感微生物的生長，選擇性促進有益菌群（如乳酸菌）生長，抑制有害菌的增殖，即引發腸道微生態的改變，這種改變對宿主產生重要影響[14]。

腸道中微生物的變化與糞便菌群的構成密切相關，因此對糞便菌群多樣性的研究可以幫助人們深入了解腸道菌群的變化[15]。本研究的目的在于灌胃蓖麻油來建立小鼠腹瀉的模型[16]，使腸道菌群失調，通過聯合使用益生菌和荔枝多酚，達到既能增強免疫力，又能促進營養吸收的雙重效果，進而為益生菌和中藥有效成分的聯合應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIMCC GIM1.730、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）GIMCC GIM1.676 廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；MRS培養基、梭菌增菌培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；荔枝多酚（荔枝皮提取，純度為95%） 華中農業大學食品學院實驗室；蓖麻油 湖北科田藥業有限公司；洛哌丁胺 西安楊森制藥有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-150F型系列生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；5804R型低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）套裝、凝膠成像儀、智能梯度PCR儀 美國Bio-Rad公司；CKX31倒置顯微鏡 日本Olympus公司；RM2255切片機 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養條件

小鼠養于屏障環境中，雌雄分開，正壓通風，空調調節溫度為（26±1）℃，光照周期12 h明12 h暗，小鼠自由飲食與飲水，適應性飼養一周。

1.3.2 菌種培養

嗜酸乳桿菌活化后，接種量為5%于MRS培養基中，培養時間為12 h，丁酸梭菌活化后接種量為5%于梭菌增菌培養基中，培養時間為24 h，溫度均為37 ℃。在上述培養條件下均達到穩定期，分別采用MRS培養基、梭菌增殖培養基3 次重復進行活菌計數，嗜酸乳桿菌濃度近似可達1010～1011CFU/mL，丁酸梭菌濃度近似可達105～106CFU/mL。按時培養后直接灌胃小鼠。

1.3.3 動物實驗分組與處理

本實驗選用96 只體質量為18～22 g的SPF級昆明小鼠，雌雄各半，隨機分為8 個處理組：正常組、模型組、洛哌丁胺組、嗜酸乳桿菌組、丁酸梭菌組、荔枝多酚組、復合菌、復合菌-荔枝多酚組，實驗周期為14 d。每天各組定時按10 mL/kg體質量灌胃藥物或無菌去離子水，其中正常組、模型組給予無菌去離子水，洛哌丁胺組按3 mg/kg灌胃；荔枝多酚組按 300 mg/kg灌胃；嗜酸乳桿菌組灌胃濃度1010～1011CFU/mL的嗜酸乳桿菌培養液；丁酸梭菌組灌胃濃度105～106CFU/mL丁酸梭菌培養液；復合菌組按上述丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌菌液以體積比1∶1混合灌胃；復合菌-荔枝多酚組：將上述丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌溶液按體積比1∶1混合灌胃，每天下午3：00復合菌-荔枝多酚組再按10 mL/kg的體質量灌胃300 mg/kg的荔枝多酚，其他組灌胃等劑量的無菌去離子水。第10 天每只按0.5 mL灌胃蓖麻油，之后每天仍按時喂藥。第14天采集小腸組織，無菌采集糞便后，按照實驗動物標準處死小鼠。

1.3.4 樣品的采集與處理

于實驗第14天后，將實驗小鼠頸椎脫臼處死，剖腹，無菌操作，收集每組4 只小鼠的新鮮直腸糞便樣本，置于-80 ℃下保存備用。再分別采取十二指腸（幽門后2～3 cm處）、空腸中段（幽門后約25 cm處）和回腸（離回盲口3 cm處）。每段腸管取2～3 cm，迅速用新配制的生理鹽水洗去腸內容物后，放在體積分數10%福爾馬林溶液中固定。按常規方法脫水、透明、石蠟包埋，連續橫斷切片，切片厚6 μm。每隔10 張切片取1 張，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。倒置顯微鏡20 倍物鏡下仔細觀察和比較小腸黏膜形態和結構的變化。選取5 張切片，每張切片取5 根最長且走向平直伸展良好的絨毛，應用明美數碼成像處理軟件，測量其絨毛長度（從絨毛基底部到絨毛頂端的距離）、最深的隱窩深度（隱窩基底部到絨毛基底部的距離）。計算絨毛長度與隱窩深度的比值（V/C）。

1.3.5 DNA的提取與PCR

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit糞便提取試劑盒，提取糞便總DNA對細菌的16S rDNA的V3區片段進行PCR[17]，PCR引物為帶有GC夾子的上下游引物（357-F：5’-GCCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；518-R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。PCR體系為：DNA模板2 μL、5×buffer 8 μL、dNTPs 1 μL、上游引物（10 mmol/L）1 μL、下游引物（10 mmol/L）1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶0.8 U，加無菌水至40 μL（以上均在冰上操作）。PCR程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個循環，最后72 ℃延伸5 min反應結束，取3 μL于質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示擴增條帶唯一，長度在250 bp左右。

對細菌16S rDNA的V3可變區的擴增產物進行DGGE分析，采用質量分數8%聚丙烯酰胺凝膠，其中尿素質量分數梯度為48%～65%。電泳采用1×TAE緩沖液，200 V電壓下預電泳10 min，隨后在70 V的固定電壓下電泳15.5 h，電泳結束后，置于磁鋼容器中，加入400 mL BioLinker DNA Red染色液染色40 min，置于凝膠成像系統中觀察拍照。

將DGGE圖譜中清晰的優勢條帶標記后，在暗室中，紫外激發條件下，用無菌手術刀割膠回收，置于已標記的200 μL PCR管中，送上海生工生物公司進行測序。將測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析，找到親緣關系最近的已知菌屬。

1.4 數據統計分析

用Quantity One 4.6.2軟件進行菌群相似性和多樣性分析，包括豐富度指數（richness，S）（即DGGE圖譜每條泳道的條帶數）和均勻度指數（evenness，E），微生物區系多樣性指數即Shannon指數（H’），按照如下公式進行計算[18]。

式中：H’為Shannon指數，H’值越大，說明群落多樣性越高；S為DGGE圖譜中條帶數量，S值越大，說明物種多樣性越高；Pi為第i條帶灰度占該樣品總灰度的比率。

微生物區系相似性指數采用NTSYS 2.10軟件進行聚類分析。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用Duncan法，使用SPSS 17.0統計軟件分析。結果以平均值±標準差表示，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 復合菌-荔枝多酚對腸道組織結構的影響

2.1.1 復合菌-荔枝多酚對小鼠十二指腸結構的影響

表1 復合菌-荔枝多酚對小鼠十二指腸結構的影響Table1 Effect of composite probiotics-litchi polyphenol on duodenum morphology of mice

由表1可知，除了洛哌丁胺組其他組小鼠十二指腸的絨毛長度均大于模型組，差異顯著（P＜0.05），其中復合菌組與正常組無顯著差異（P＞0.05）；嗜酸乳桿菌組隱窩深度顯著低于模型組（P＜0.05），與正常組無顯著差異，其他組與模型組差異不顯著（P＞0.05）；V/C值表現為嗜酸乳桿菌組和復合菌組均顯著大于模型組（P＜0.05），其他組間差異不顯著（P＞0.05）。可以看出腹瀉小鼠灌胃益生菌或荔枝多酚后，能明顯提高小鼠十二指腸的絨毛長度和V/C值，其中嗜酸乳桿菌和復合菌效果最佳。

圖1 十二指腸組織病理學變化（×200）Fig.1 Histopathological change of duodenum (× 200)

由圖1可知，正常組十二指腸腸壁層次清晰、絨毛結構完整、排列緊密，嗜酸乳桿菌組和復合菌組絨毛修長、豐滿，荔枝多酚組和復合菌-荔枝多酚組絨毛纖細，可以明顯看出嗜酸乳桿菌組和復合菌組對蓖麻油腹瀉小鼠十二指腸的影響最大。

2.1.2 復合菌-荔枝多酚對小鼠空腸結構的影響

表2 復合菌-荔枝多酚對小鼠空腸結構的影響Table2 Effect of composite probiotics-litchi polyphenol on jejunum morphology of mice

由表2可知，洛哌丁胺組小鼠空腸絨毛長度小于模型組，差異顯著（P＜0.05），其他組間差異不顯著（P＞0.05），且均顯著低于正常組（P＜0.05）。6 個處理組小鼠空腸的隱窩深度均顯著低于模型組（P＜0.05），而且組間差異不顯著（P＞0.05）。V/C值表現為嗜酸乳桿菌組、丁酸梭菌組、復合菌組和復合菌多酚組均顯著大于模型組（P＜0.05），丁酸梭菌組與正常組無顯著差異（P＞0.05）。可以看出腹瀉小鼠灌胃復合菌-荔枝多酚后，能明顯提高小鼠十二指腸的絨毛長度和V/C值。

圖2 空腸組織病理學變化（×200）Fig.2 Histopathological change of jejunum (× 200)

由圖2可知，模型組和洛哌丁胺組絨毛寬且短小，嗜酸乳桿菌組、復合菌組和復合菌-荔枝多酚組絨毛修長、整齊，表明嗜酸乳桿菌組、丁酸梭菌組、復合菌組和復合菌-荔枝多酚組有助于腹瀉小鼠空腸腸黏膜損傷修復。2.1.3 復合菌-荔枝多酚對小鼠回腸結構的影響

表3 復合菌-荔枝多酚對小鼠回腸結構的影響Table3 Effect of composite probiotics-litchi polyphenol on ileum morphology of mice

從表3可以看出，嗜酸乳桿菌組和復合菌-荔枝多酚組小鼠回腸絨毛長度大于模型組，差異顯著（P＜0.05），與正常組無顯著差異（P＞0.05）。所有組小鼠隱窩深度與模型組均差異不顯著（P＞0.05）。V/C值表現為嗜酸乳桿菌組、復合菌組和復合菌-荔枝多酚組均顯著大于模型組（P＜0.05），與正常組無顯著差異（P＞0.05），表明腹瀉小鼠灌胃益生菌或荔枝多酚后，能明顯提高小鼠十二指腸的絨毛長度和V/C值，其中嗜酸乳桿菌和復合菌效果最佳。

由圖3可知，模型組和洛哌丁胺組絨毛比較短小，嗜酸乳桿菌組、復合菌組和復合菌-荔枝多酚組絨毛修長、整齊，可以看出嗜酸乳桿菌組、復合菌組、復合菌多酚組對蓖麻油腹瀉小鼠回腸腸黏膜損傷有修復作用。

圖3 小鼠回腸組織病理學變化（×200）Fig.3 Histopathological change of ileum (× 200)

2.2 復合菌-荔枝多酚對小鼠腸道菌群的影響

通過PCR-DGGE對小鼠糞便腸道菌群進行檢測，對DGGE圖譜上所顯示的優勢條帶進行回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司克隆并且進行測序，最后對測序的結果進行BLAST比對、NTSYS 2.10相似性聚類分析及圖譜多樣性指數分析。

圖4 小鼠糞便細菌微生物區系16S rDNA V3區DGGE圖譜Fig.4 DGGE profiles obtained with universal primers for V3 of 16S rDNA of fecal microbiota

如圖4所示，各組有個別條帶發生了輕微的變化，如條帶2、6、8是灌胃復合菌-荔枝多酚后新出現的，條帶3是灌胃復合菌后新出現的，條帶10是灌胃丁酸梭菌、嗜酸乳桿菌后新出現的，條帶9是嗜酸乳桿菌組和丁酸梭菌組的優勢菌種，而條帶1、4、7、11、12、13是所有組的優勢菌種。

為進一步了解各組對小鼠結腸中微生物群落的影響，對DGGE圖譜中相關條帶進行了測序分析。由表4可知，其中，條帶2鑒定為膽型螺旋桿菌（Helicobacter bilis），條帶6、8鑒定為梭狀芽孢桿菌（[Clostridium]polysaccharolyticum）、條帶3鑒定為[真細菌]哈利菌（[Eubacterium] hallii），條帶10鑒定為乳酸菌（Lactobacillus taiwanensis），條帶9鑒定為擬桿菌（Bacteroides chinchillae），條帶1、4、7、11、12、13分別鑒定為擬桿菌（Bacteroides chinchillae）、艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）、洛氏普雷沃菌（Prevotella loescheii）、長雙歧桿菌（Stomatobaculum longum）、Alistipes senegalensis、費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）。

表4 DGGE圖譜中特異條帶的測序比對結果Table4 Sequence alignment of specific bands in DGGE profile

圖5 小鼠糞便微生物系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of mouse fecal microorganisms

采用NTSYS 2.10軟件對DGGE圖進行數字化和聚類分析，聚類分析的結果如圖5所示。發現正常組和其他各組形成了一定程度的分界，樹狀圖明顯分成了兩大簇，其中正常組全部聚在了一簇，組內比較集中，個體差異不大；相似性系數大于75%，而其他組聚成另外一簇，相似性系數都大于73%，表明蓖麻油腹瀉后的小鼠的腸道菌群結構組成有了明顯的變化。給藥各組內比較分散，個體差異比較大。其中復合菌-荔枝多酚組比較分散，沒有形成一簇，說明個體差異比較大。

由表5可以看出，嗜酸乳桿菌組、復合菌組和復合菌-荔枝多酚組能增加蓖麻油腹瀉后小鼠腸道菌群的豐富度，均顯著大于模型組和正常組（P＜0.05），說明嗜酸乳桿菌、復合菌和復合菌-荔枝多酚能增加菌群的數量；復合菌組和復合菌-荔枝多酚組的菌群均勻度顯著大于模型組和正常組（P＜0.05），從中可以看出灌胃復合菌、復合菌-荔枝多酚的小鼠腸道菌群的微生態穩定性有所增強，復合菌組的Shannon指數顯著大于模型組和正常組（P＜0.05），其他組之間差異并不顯著，說明小鼠腸道中的菌群多樣性增大，群落的復雜程度增高。丁酸梭菌組和荔枝多酚組的豐富度指數、均勻度指數、Shannon指數與模型組和正常組均差異不顯著（P＞0.05），說明小鼠腸道中的菌群豐富度、多樣性、復雜程度增高是嗜酸乳桿菌在起主導作用。

表5 小鼠腸道菌群DGGE圖譜多樣性指數分析Table5 Diversity indices based on DGGE profile of intestinal microflora in mice

3 討 論

小腸絨毛的發育狀況決定了營養物質的吸收和利用的情況，因為腸道內小腸吸收營養物質的主要部位，絨毛高度越高，成熟的細胞就越多，吸收能力就會越強，反之，吸收能力就越差[19-21]，V/C值可以綜合反映小腸營養吸收的狀況，絨毛長度增加，隱窩深度降低，V/C值就會增大，營養吸收的能力就會增加[23]。實驗結果顯示，嗜酸乳桿菌和復合菌能提高十二指腸、空腸的V/C值，丁酸梭菌能增加空腸的V/C值，復合菌-荔枝多酚能增加空腸和回腸的V/C值。已有研究發現益生菌（嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌）可以在小鼠的腸道內壁黏附、定植，產生有益物質改善腸道菌群，還能夠通過增長腸絨毛的高度、降低小腸隱窩的深度，促進機體對營養物質的吸收[24-25]。本研究結果與前人相似，說明復合菌與荔枝多酚聯用可在一定程度上增進腸道的消化吸收能力。

人體內腸道菌群如果失衡，腸道內環境就會發生變化，從而引起宿主代謝和免疫紊亂[22]，使人體處于亞健康狀態，甚至引發糖尿病和高血壓等慢性疾病[26]。已有報道表明乳酸菌可以提高腸道內免疫力，促進腸道菌群恢復平衡狀態的作用[27]。對比整個DGGE圖譜可見，嗜酸乳桿菌、復合菌和復合菌-荔枝多酚能增加蓖麻油腹瀉后小鼠菌群的數量，增強腸道菌群的微生態穩定性，而且復合菌還能增高群落的復雜程度。復合菌與荔枝多酚聯用未增加群落的復雜程度，可能是荔枝多酚具有抑菌、提高機體免疫力、預防疾病的作用[28]，從而抑制了有害菌的生長，導致菌群多樣性、群落的復雜程度降低。這與唐艷等研究相一致，中草藥所含的有效成分可以抑制有害菌：大腸桿菌、沙門氏菌的增殖等，最終會降低有害菌的數量[29]。本研究測序結果顯示，各給藥組條帶與正常組和模型組相比，增加了優勢條帶，復合菌組和復合菌-荔枝多酚組還出現了新的條帶，說明復合菌和復合菌-荔枝多酚不僅能有效地提高小鼠腸道的豐富度，增加小鼠腸道微生物的多樣性，還能夠促進腸道內部某些菌群的生成，優化小鼠腸道微生物菌群結構，所有給藥組中復合菌體現出了更好的效果。