復合護色劑預處理及不同凍融條件對冷凍雙孢蘑菇品質的影響

胡 燁，胡秋輝，郁志芳，裴 斐，馬 寧，楊文建,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇，是一種食用廣泛、營養價值豐富的食用菌，色質白嫩，肉質肥厚[1]，其富含甘露醇、菌糖、有機堿、礦物質和蛋白質，是典型的高蛋白、低脂肪、低能量的菌類保健食品。近年來雙孢蘑菇市場需求量與日俱增，隨之而來的雙孢蘑菇采后保鮮及加工問題被廣泛關注和研究[2]。雙孢蘑菇含水量高，組織結構柔嫩，菌蓋表面沒有保護結構，易損傷褐變，常溫下采后2 d內菇體內的水分就會大量蒸發散失，使得雙孢蘑菇干扁皺縮，商品價值和食用價值大大降低[3]。

隨著冷鏈物流的發展，冷凍技術被應用于雙孢蘑菇的采后加工過程[4]，一定程度上解決了雙孢蘑菇的褐變問題。冷凍貯藏是有效延長農產品貨架期的加工方式之一，能夠最大限度地保持其感官品質和營養價值。李清明等[5]對冷凍雙孢蘑菇進行護色研究，結果表明氯化鈉和異抗壞血酸鈉溶液作為護色液，對雙孢蘑菇褐變有顯著抑制作用，但其未對雙孢蘑菇冷凍方面深入研究，僅停留在護色層面。Jaworska[6]、Islam[7]等從冷凍角度對雙孢蘑菇的質構進行研究，結果表明通過抗壞血酸和檸檬酸預處理的雙孢蘑菇經冷凍處理比未經冷凍處理的質地更好。Júnior等[8]研究發現，-20 ℃低溫保存不能有效保持雙孢蘑菇的菌絲活力，但-75 ℃的低溫冷凍保存可以有效保持雙孢蘑菇的菌絲活力。以上研究都表明，冷凍能夠有效保留食用菌營養價值，并保持其良好的質構特性。然而，常規冷凍后的雙孢蘑菇，解凍后汁液流失過高，雙孢蘑菇容易出現斷裂、皺縮、褐變及菇形坍塌等品質劣變現象，此類問題仍未得到有效的解決[9]。因此，開發一種適用于雙孢蘑菇的護色預處理技術以及凍融工藝成為提升冷凍雙孢蘑菇品質的關鍵。

本研究以雙孢蘑菇為材料，優化復合護色劑的配比，并比較不同凍融方法（-80、-40、-20 ℃冷凍，4 ℃或25 ℃解凍）對經過復合護色劑預處理的雙孢蘑菇品質的影響，為提升冷凍雙孢蘑菇的品質提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇由江蘇天豐生物科技有限公司提供。

異抗壞血酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸、L-半胱氨酸國藥集團化學試劑有限公司；過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

AL1043電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Spectra Max 190酶標儀 美國美谷分子儀器（上海）有限公司；TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；TM3000掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DW-40W10醫用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；ULT-1386-5-V42超低溫冰箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；NMI20-Analyst 核磁共振分析儀蘇州（上海）紐邁電子科技有限公司；DT-8891E電熱偶深圳華盛昌機械實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 護色處理

挑選新鮮無機械損傷的雙孢蘑菇，經去根和清洗后，切成（10.0±0.5）mm厚的雙孢蘑菇片，按料液比1∶4（m/V）加入護色劑，25 ℃浸泡處理30 min，雙孢蘑菇經護色劑浸泡后，置于網格盤自然瀝干后，立即測定褐變度。按照表1的設計進行雙孢蘑菇冷凍前的單一護色劑優化；在單一護色劑質量濃度優化研究結果的基礎上，進一步利用4因素3水平的正交試驗（表2）優化異抗壞血酸鈉、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸4 種護色劑的最佳配比。

表1 單一護色劑質量濃度優化設計Table1 Optimization design for individual use of browning inhibitors at different concentrations

表2 異抗壞血酸鈉、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸復合護色劑的質量濃度設計Table2 Three concentrations levels of sodium isoascorbate, citric acid,ascorbic acid and L-cysteine for their combined use g/L

1.3.2 褐變抑制率測定

稱取5.0 g經護色劑處理的雙孢蘑菇切片，冰浴條件下用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）勻漿并定容至25 mL，5 000 r/min離心10 min提取色素，取上清液，用酶標儀在450 nm波長處測吸光度。褐變度抑制率由式（1）計算。

式中：A0、Am分別表示新鮮雙孢蘑菇和經護色劑處理后雙孢蘑菇的吸光度。

1.3.3 冷凍過程中雙孢蘑菇溫度變化曲線繪制

將電熱偶的溫度傳感探頭插入雙孢蘑菇切片中心，將雙孢蘑菇切片分別放入-20、-40、-80 ℃冰箱內，每30 s記錄1 次雙孢蘑菇中心溫度，繪制冷凍過程中的溫度變化曲線。

1.3.4 POD活力測定

POD活力的測定參考文獻[10]。稱取5.0 g雙孢蘑菇，與生理鹽水按照料液比1∶9（m/V）在冰浴條件下制備成1 g/10 mL的組織勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液進行POD活力測定。37 ℃條件下每毫克組織蛋白每分鐘催化產生1 μg底物的酶量定義為一個POD活力單位，單位為U/mg。

1.3.5 冷凍雙孢蘑菇的解凍溫度優化

將在不同溫度下冷凍25 min的雙孢蘑菇分別置于4 ℃和25 ℃解凍60 min。通過測定汁液流失率研究不同解凍溫度對雙孢蘑菇品質的影響。冷凍雙孢蘑菇在解凍前稱質量，解凍后用濾紙拭去雙孢蘑菇表面的汁液，然后稱質量，計算樣品解凍后減少的質量占樣品原質量的百分率，即為汁液流失率。

1.3.6 雙孢蘑菇掃描電子顯微鏡觀察

先將雙孢蘑菇切成1 mm×1 mm×1 mm正方體，然后在體積分數4%戊二醛固定液中固定1 h，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）漂洗3 次，每次15 min。再依次用體積分數為50%、70%、80%、90%、100%的叔丁醇脫水，每次15 min；然后將樣品凍干后，將樣品固定在樣品托上，采用離子濺射儀在觀察樣品的橫斷面上噴金，掃描電子顯微鏡（500 倍）觀察[11]。

1.3.7 雙孢蘑菇水分分布的測定

利用NMI20-Analyst核磁共振分析儀測定雙孢蘑菇橫向弛豫時間（T2）曲線。儀器參數：測量溫度32 ℃，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脈沖序列，線圈直徑15 mm，回波數4 000，累計掃描4 次。采用核磁共振方法測定雙孢蘑菇中的水分分布狀態[12]，利用核磁成像儀檢測雙孢蘑菇中間層面水信號的變化。使用橫向弛豫時間T2加權成像序列，檢測參數為：重復時間1 400 ms；回波時間85 ms；采集次數4 次。雙孢蘑菇水分分布測定區域（從雙孢蘑菇片中間切取5 mm）如圖1所示。

圖1 樣品測定區域示意圖Fig.1 Schematic diagram of the sample measurement area

1.3.8 雙孢蘑菇質構特性的測定

解凍后的雙孢蘑菇采用TA-XT2i質構儀進行質構特性的測定[13]，測定參數為：P6探頭，探頭預備速率2.00 mm/s，測定速率1.00 mm/s，測后速率5.00 mm/s，探頭插入雙孢蘑菇中心部位，深度5 mm。

1.4 數據分析

采用Origin 8.5.1軟件進行數據處理和作圖，JMP 10軟件進行數據統計分析，利用Duncan法進行多重分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單一護色劑對雙孢菇褐變抑制率的影響

添加護色劑是果蔬加工過程中常用的護色方法，其中異抗壞血酸鈉、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸是幾種常見的護色劑。異抗壞血酸鈉是一種公認安全的食品添加劑，可將體系中的醌類及其衍生物還原成酚類，防止醌類物質形成黑色素[14]，從而起到護色作用；檸檬酸是金屬離子螯合劑，可以螯合Cu2+、Mg2+、Fe2+多價金屬離子，這些金屬離子通常為酶的作用輔基，缺乏它們會使酶的催化活性下降；抗壞血酸是一種抗氧化劑，可以清除氧自由基[15]；L-半胱氨酸抑制雙孢蘑菇褐變的作用機理在于它既可作用于產物多巴醌生成穩定的無色物質，又可通過與酶蛋白不可逆結合而作用于酶蛋白[16]。由圖2可知，隨著護色劑使用質量濃度的升高，雙孢蘑菇抑制率總體趨勢都是先增后降，異抗壞血酸鈉、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸的質量濃度分別為2.5、8.0、0.6、1.5 g/L時，對雙孢蘑菇的褐變抑制率達到最高。發生這種現象的原因可能為：在一定質量濃度范圍內異抗壞血酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸、L-半胱氨酸對過氧化物酶活性起著很好的抑制作用，超過一定質量濃度后，雙孢蘑菇自身發生非酶促褐變，褐變程度加深，抑制效果下降[17]。

圖2 不同質量濃度異抗壞血酸鈉（A）、檸檬酸（B）、抗壞血酸（C）、L-半胱氨酸（D）對雙孢蘑菇褐變抑制率的影響Fig.2 Effects of isoascorbic acid sodium (A), citric acid (B),ascorbic acid (C), L-cysteine (D) on the browning of Agaricus bisporus

2.2 復合護色劑質量濃度優化

表3 雙孢蘑菇復合護色劑正交試驗設計方案與結果Table3 Orthogonal array design with experimental results for optimization of combined use of four browning inhibitors

極差和均值越大，對樣品褐變抑制率影響越大，由表3極差和均值大小可知，4 種護色劑對雙孢蘑菇切片褐變抑制率大小順序為：異抗壞血酸鈉（A）＞L-半胱氨酸（D）＞抗壞血酸（C）＞檸檬酸（B），所測定復合護色劑最佳組合為A3B3C1D2，即3.0 g/L異抗壞血酸鈉、10.0 g/L檸檬酸、0.4 g/L抗壞血酸、1.5 g/L L-半胱氨酸，經驗證該組合復合護色劑處理的雙孢蘑菇褐變抑制率為85.32%，比使用單一護色劑和其他復合護色劑護色效果顯著提高，抑制效果佳。與何繼文等[18]對復合護色劑研究結果一致，利用復合護色劑各成分之間的協同作用，能有效提高對褐變抑制效果。

2.3 不同冷凍溫度下雙孢蘑菇的溫度曲線

圖3 不同冷凍溫度下雙孢蘑菇的中心溫度變化曲線Fig.3 Temperature curves of Agaricus bisporus at different frozen temperatures

冷凍的溫度和時間是影響細胞組織結構的兩個重要變量[19]，冷凍溫度越低，形成的冰晶體越小，對雙孢蘑菇的微觀結構破壞越小[20]。不同冷凍溫度下雙孢蘑菇的中心溫度變化如圖3所示，-80 ℃下冷凍25 min左右雙孢蘑菇的中心溫度達到-18 ℃，而-40 ℃與-20 ℃冷凍條件下，雙孢蘑菇的中心溫度降至-18 ℃所用時間分別為93.5 min和185 min。-80 ℃冷凍雙孢蘑菇相比于-40 ℃與-20 ℃所用的降溫時間短，凍結速率快，雙孢蘑菇冰晶小，對細胞結構破壞小。

2.4 不同凍融溫度對雙孢蘑菇POD活力的影響

圖4 不同凍融溫度對雙孢蘑菇POD活力的影響Fig.4 Effects of different freeze-thaw temperatures on POD activity of Agaricus bisporus

POD是雙孢蘑菇體內廣泛分布的一類氧化還原酶，可催化由過氧化氫參與的各種物質的氧化反應，其活力能有效反映雙孢蘑菇抗氧化能力[21]。如圖4所示，4 ℃解凍的冷凍雙孢蘑菇POD活力顯著高于25 ℃解凍的雙孢蘑菇。隨著冷凍溫度升高，酶活力降低，其中-80 ℃冷凍、4 ℃解凍雙孢蘑菇的POD活力最高，為35.9 U/mg，最接近新鮮樣品的POD活力（45 U/mg），而-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的雙孢蘑菇的POD活力最低，為17.7 U/mg。-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇POD活力最高，表明-80 ℃冷凍4 ℃解凍雙孢蘑菇抗氧化能力較好，品質保持良好。

2.5 不同凍融溫度對雙孢蘑菇汁液流失率的影響

含水率較高的雙孢蘑菇在凍結時，其體系內的水分轉變為冰晶體，細胞結構中的蛋白質等組分會發生一定的變性，結構類物質會有所流失，導致整個體系的持水性顯著下降[22]；當解凍時冰晶融化成的水分并不能完全被雙孢蘑菇細胞重新吸收，就會產生汁液流失。如圖5所示，25 ℃解凍的雙孢蘑菇汁液流失率顯著高于4 ℃解凍的雙孢蘑菇（P＜0.05）。-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇汁液流失率最低，為1.98%，而-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的雙孢蘑菇汁液流失率最高，為17.15%。造成這種現象的原因為-20 ℃冷凍、25 ℃解凍組凍結速率小，冰晶大，細胞結構破壞大，解凍速率大，冰晶融化速率快，汁液流失率高[23]。

圖5 凍融溫度對雙孢蘑菇汁液流失率的影響Fig.5 Effect of different freeze-thaw temperatures on drip loss of Agaricus bisporus

2.6 不同凍融溫度對雙孢蘑菇T2的影響

圖6 不同凍融溫度條件下雙孢蘑菇的T2變化Fig.6 Changes in transverse relaxation time (T2) of Agaricus bisporus at different freeze-thaw temperatures

雙孢蘑菇中含有大量的水分，水分的分布、狀態及其在雙孢蘑菇中的遷移情況對雙孢蘑菇的外觀形狀、新鮮度、腐敗程度等有顯著影響[24]。0～1 ms（I）為結合水，此部分水分子與生物大分子間緊密結合，動力學活性較小；1～100 ms（II）為多層水，此部分水分流動性受到限制；100～1 000 ms（III）為自由水，此部分水分流動性強。如圖6A、B所示，隨著冷凍溫度的升高，解凍樣品水分信號峰向右遷移，水分的流動性增強，這是由于較高溫度冷凍樣品時，形成冰晶越大，對細胞破壞越大[25]。25 ℃解凍樣品和4 ℃解凍樣品在區域I與區域II信號強度無明顯差別，25 ℃解凍樣品區域III信號強度明顯低于4 ℃解凍樣品，表明25 ℃解凍樣品自由水流失多，汁液流失率高；這種現象是由于解凍溫度越高，解凍速度過快，細胞間隙的冰晶體快速融化后沒有充足時間復水，汁液流失增多[23]。其中-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇橫向弛豫時間信號峰最接近新鮮雙孢蘑菇的信號峰，說明細胞間自由水含量最高，水分易流失，由于冷凍溫度低，形成的冰晶體小，對雙孢蘑菇結構破壞程度最小，組織持水能力最強，在解凍溫度低的條件下，汁液流失率低，內部水分含量高。-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的雙孢蘑菇自由水含量低，冷凍形成的冰晶體大，對雙孢蘑菇結構破壞程度最大，解凍后汁液流失最多，內部自由水含量低。

圖7 凍融溫度對雙孢蘑菇水分分布的影響Fig.7 Effect of different freeze-thaw temperatures on moisture distribution of Agaricus bisporus

根據橫向弛豫時間T2加權成像原則，含水率高的部分信號區域顯亮，含水率低的部分信號區域顯暗[26]。如圖7所示，4 ℃解凍的雙孢蘑菇顯著亮于25 ℃解凍的雙孢蘑菇，說明4 ℃解凍的雙孢蘑菇水分明顯高于25 ℃解凍的雙孢蘑菇，其中-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇顯亮區域最大，表明含水量最高，-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的雙孢蘑菇顯亮區域最小，表明該部分含水量低。有研究表明[19]，冷凍雙孢蘑菇的溫度越低，形成的冰晶越小，對雙孢蘑菇的組織結構破壞越小，雙孢蘑菇組織持水能力越高，解凍后汁液流失顯著降低。解凍的溫度越高，相同解凍時間汁液流失越多，發生這種現象的原因是解凍溫度越高，冰晶體融化速度越快，雙孢蘑菇汁液流失顯著增高，雙孢蘑菇內部水分含量顯著降低。

2.7 不同凍融溫度對雙孢蘑菇微觀結構的影響

圖8 凍融溫度對雙孢蘑菇外觀和微觀結構的影響Fig.8 Effect of different freeze-thaw temperatures on the microstructure of Agaricus bisporus

新鮮雙孢蘑菇組織結合緊密并保持完整的結構，呈較為規則的孔狀結構[27]。雙孢蘑菇在冷凍過程細胞間形成冰晶體，體積膨脹，解凍過程冰晶體融解，孔狀結構變得疏松，雙孢蘑菇持水能力下降，汁液流失增多[28]。解凍過程汁液流失可導致雙孢蘑菇體失水坍塌，引起組織結構變形和皺縮。由圖8可知，4 ℃解凍的雙孢蘑菇色澤比25 ℃解凍的雙孢蘑菇白嫩，孔狀結構緊密，其中-80 ℃冷凍、4 ℃解凍條件的雙孢蘑菇色澤最白，孔狀結構最緊密，-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的雙孢蘑菇色澤最暗，表面出現大面積褐色，孔狀結構最疏松。發生這種現象的原因是雙孢蘑菇冷凍溫度越低，形成冰晶體越小，對組織結構破壞越小，孔狀結構維持較好，雙孢蘑菇表面褐色面積越小。因此，-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇保持了良好的孔狀結構，而-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的雙孢蘑菇結構疏松，孔狀結構被明顯破壞。

2.8 不同凍融溫度對雙孢蘑菇質構的影響

表4 凍融溫度對雙孢蘑菇質構的影響Table4 Effect of different freeze-thaw temperatures on texture characteristics of Agaricus bisporus

質構特性是衡量冷凍過程農產品品質變化的重要指標，凍融過程中微觀結構特性的改變直接關系到果蔬質構特性（硬度、彈性、咀嚼度）的變化[29]。由表4可知，4 ℃解凍的雙孢蘑菇硬度高于25 ℃解凍的雙孢蘑菇；相同解凍溫度下，隨著冷凍溫度的升高，硬度降低，其中-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的硬度最高，-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的硬度最低。與25 ℃解凍的雙孢蘑菇相比，4 ℃解凍的雙孢蘑菇的彈性更高，而咀嚼度更低；解凍溫度相同時，咀嚼度隨著冷凍溫度上升而上升，-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇咀嚼度最低，-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的咀嚼度最高；而彈性變化趨勢是隨著冷凍溫度上升而下降，-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇彈性最高，-20 ℃冷凍、25 ℃解凍的彈性最小。發生現象的原因是冷凍溫度低，形成冰晶體小，對細胞的破壞較小，解凍溫度低可以使雙孢蘑菇細胞快速復水，膨壓有所回升，從而能夠較好地保持樣品的質構特性[30]。綜上所述，-80 ℃冷凍、4 ℃解凍的雙孢蘑菇質構特性最佳。

3 結 論

經3.0 g/L異抗壞血酸鈉、1.5 g/L L-半胱氨酸、0.4 g/L抗壞血酸、10.0 g/L檸檬酸復合護色劑浸泡30 min后，通過-80 ℃冷凍25 min、4 ℃解凍60 min的凍融條件處理雙孢蘑菇時，雙孢蘑菇片汁液流失率最低，POD活力最高，質構特性最好，色澤更接近新鮮樣品，水分含量最高。結合上述在-80 ℃冷凍、4 ℃解凍條件下，雙孢蘑菇品質較佳，更符合工業化生產需求。