乳源抗菌肽復(fù)合生物保鮮劑對(duì)冷卻牛肉貨架期的影響

黃明焜，師振強(qiáng)，李志成*，夏效東，孫艷文

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

冷卻肉在冷藏過程中完成后熟，后熟使肉質(zhì)變得柔軟而富有彈性，鮮味氨基酸得到釋放，使肉變得美味。冷卻肉的安全性、營養(yǎng)性和質(zhì)構(gòu)特性均優(yōu)于熱鮮肉和冷凍肉，因此已經(jīng)成為生鮮肉發(fā)展的必然趨勢。冷卻肉在生產(chǎn)和流通過程中雖然一直處于低溫（0～4 ℃），但一些嗜冷微生物仍可以生長繁殖，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）等。低溫條件下嗜冷微生物的新陳代謝速度雖然受到抑制，但大量導(dǎo)致冷卻肉腐敗變質(zhì)的微生物仍可繁殖[1-2]。因此冷卻肉保鮮的關(guān)鍵在于抑制微生物生長繁殖，可通過降低原料肉初始菌落總數(shù)以及控制貯藏溫度來延長冷卻肉的貨架期[3]。

天然保鮮劑主要來源于動(dòng)植物原料，以及利用工程菌發(fā)酵得到的產(chǎn)物[4]，其使用劑量低且保鮮效果好，同時(shí)具有安全、天然、高效、抑菌譜廣等特點(diǎn)[5]。乳源抗菌肽是通過酶工程技術(shù)制備的一類活性肽，是一種新型天然綠色保鮮劑[6-7]。抗菌肽具有分子質(zhì)量小、耐熱性強(qiáng)、水溶性好、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)[8]。蘇晉文[9]、王盼[10]等使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白，得到的抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有很強(qiáng)的抑制作用。乳酸鏈球菌素（Nisin）由34 個(gè)氨基酸殘基組成，對(duì)革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的殺菌作用，但對(duì)革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌的抑制效果差。殼聚糖是一種天然堿性多糖，具有良好的抑菌性、成膜性、安全性和吸附性[11]，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)為食品添加劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)加工中[12-14]。茶多酚主要功能成分為兒茶素類化合物，具有優(yōu)異的抗氧化和抗菌活性[15]。丁香花蕾精油（丁香精油）的主要活性成分丁香酚具有抗菌和殺蟲作用[16]。于見亮等[17]對(duì)Nisin、茶多酚和殼聚糖進(jìn)行復(fù)配應(yīng)用于冷卻羊肉保鮮中，結(jié)果表明Nisin和殼聚糖之間存在極顯著的交互作用（P＜0.01）。Li Tingting等[18]研究表明，茶多酚與Nisin、殼聚糖復(fù)合使用時(shí)能發(fā)揮協(xié)同作用，可以達(dá)到更強(qiáng)的抑菌效果。張慧蕓等[19]研究表明，丁香精油與殼聚糖制成的復(fù)合可食用膜可有效抑制冷卻肉菌落總數(shù)和高鐵肌紅蛋白含量的增加，同時(shí)還可以抑制冷卻肉貯藏過程中脂肪氧化，顯著延長冷卻肉的貨架期。但是冷卻肉貨架期得到有效延長的同時(shí)無法保持良好的色澤及組織狀態(tài)，目前乳源抗菌肽結(jié)合多種天然保鮮劑應(yīng)用于冷卻肉保鮮及貨架期模型構(gòu)建的研究較少，而企業(yè)又亟需該技術(shù)的支持。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過均勻試驗(yàn)研究乳源抗菌肽、Nisin、殼聚糖、茶多酚和丁香精油復(fù)配保鮮劑對(duì)冷卻牛肉的保鮮效果，分析各天然保鮮劑之間的交互作用。利用適宜的復(fù)合天然保鮮劑處理冷卻牛肉，-1～6 ℃條件下貯藏，以微生物生長動(dòng)力學(xué)模型結(jié)合Arrhenius方程建立冷卻牛肉的貨架期預(yù)測模型，為延長和預(yù)測冷卻牛肉的保鮮期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛肉（成年秦川牛肉）分別在5、6、11、12月清晨購于陜西省咸陽市楊凌區(qū)新康樂市場，其中5、6月購買的牛肉樣品測定揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、pH值和菌落總數(shù)，11、12月購買的牛肉樣品測定菌落總數(shù)，由于夏季和冬季氣溫差異大，購買的樣品初始菌落總數(shù)不相同；新鮮無抗西農(nóng)莎能山羊乳 西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧場。

Nisin、殼聚糖、茶多酚（均為食品級(jí)） 山東福瑞達(dá)生物科技有限公司；丁香精油 鄭州雪麥龍食品香料有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g） 美國Sigma公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10酸度計(jì)、JA3003型電子分析天平 德國賽多利斯公司；HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)；L5紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BCD-450ZE9H型冰箱 合肥美菱股份有限公司；PYXDHS-40×50-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 乳源抗菌肽的制備

1.3.1.1 乳酪蛋白粗品的制備

新鮮無抗山羊乳在4 ℃、5 000 r/min條件下離心20 min脫脂，2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5±0.1，40 ℃水浴靜置30 min沉淀酪蛋白，將酪蛋白沉淀液以5 000 r/min離心10 min去除上清液，用0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液洗滌酪蛋白沉淀2 次，每次洗滌后以4 000 r/min離心10 min，所得沉淀物即為酪蛋白粗品[20]。按凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[21]）測定其蛋白含量為17.36 g/100 g。

1.3.1.2 羊乳酪蛋白酶解物的制備

稱取適量酪蛋白粗品，置于250 mL三角瓶中，加入少量0.1 mol/L NaOH溶液助溶，加水至100 mL（蛋白質(zhì)含量為80 g/kg），沸水浴加熱10 min殺菌，冷卻至室溫后置于37 ℃的恒溫水浴鍋中，待粗酪蛋白溶液中心溫度與水浴鍋溫度一致后，調(diào)節(jié)pH值至1.5±0.1，準(zhǔn)確加入3 000 U/g胃蛋白酶，酶解過程中用2 mol/L NaOH溶液維持pH值為1.5±0.1，酶解2 h，沸水浴加熱10 min滅酶，冷卻至室溫后5 000 r/min 離心15 min，所得上清液即為乳源抗菌肽[10]。參考魯偉等[22]的方法測定其活性肽質(zhì)量濃度為14.94 g/L。

1.3.2 復(fù)合保鮮劑的制備

具體按表1的添加量，將乳源抗菌肽（1.3.1.2節(jié)制備所得）、Nisin、茶多酚和丁香精油加入到無菌蒸餾水中，攪拌溶解后加入殼聚糖，逐滴加入食品級(jí)冰醋酸并不斷攪拌，當(dāng)pH值為4.4～5.0時(shí)，殼聚糖完全溶解，此時(shí)得到均勻穩(wěn)定的復(fù)合保鮮劑溶液。

表1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Factors and levels used for uniform design

1.3.3 肉樣的處理

在無菌條件下，將當(dāng)天購買的新鮮牛肉去除脂肪、筋膜，分割成形狀規(guī)則的肉塊，每塊質(zhì)量約50 g，隨機(jī)分為16 組，每組3 塊。在對(duì)應(yīng)保鮮劑中浸泡3 min后瀝干，放入無菌均質(zhì)袋中，（4±1）℃條件下貯藏，并設(shè)置未添加保鮮劑的空白組。保鮮劑的添加按照均勻試驗(yàn)的擬水平法，通過U16（84）均勻試驗(yàn)，每組均加入22.5 g/L殼聚糖，其他保鮮劑的添加量見表1。（4±1）℃冷藏24 d后，以TVB-N含量、pH值和菌落總數(shù)為指標(biāo)，確定復(fù)合保鮮劑適宜配比。之后取新鮮牛肉處理后分為2 組，每組18 塊，在復(fù)合保鮮劑中浸泡3 min后瀝干，放入無菌均質(zhì)袋中，置于4 ℃條件下貯藏，每隔5 d檢測TVB-N含量、pH值和菌落總數(shù)，驗(yàn)證復(fù)合保鮮劑的保鮮效果。GB 2707—2016《鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》[23]中新鮮肉的要求為TVB-N含量不超過15 mg/100 g，pH值不超過6.2，菌落總數(shù)不超過106CFU/g。

1.3.4 冷卻肉貨架期模型的構(gòu)建

將經(jīng)過復(fù)合保鮮劑處理的冷卻牛肉分別置于-1、2、4、6 ℃條件下貯藏54 d，每隔6 d檢測菌落總數(shù)。采用微生物生長動(dòng)力學(xué)模型描述一定條件下微生物數(shù)量變化與時(shí)間的關(guān)系，一級(jí)模型方程見式（1）。

式中：t表示貯藏時(shí)間/d；y0表示初始菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值（lg（CFU/g））；y表示t時(shí)的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值（lg（CFU/g））；ky表示微生物生長速率/d-1。

采用Arrhenius方程[24]描述溫度與微生物生長速率ky之間的二級(jí)模型，具體表達(dá)見式（2）。

式中：k0為頻率因子/d-1；EA為活化能/（J/mol）；T為熱力學(xué)溫度/K；R為摩爾氣體常數(shù)（約為8.314 J/（mol·K））；ky是微生物生長速率/d-1。

根據(jù)式（3）通過ln ky對(duì)1/T作圖，得到斜率為-EA/R的線性方程，同時(shí)得到常數(shù)k0和EA的值，則可通過式（4）得到冷卻牛肉貨架期（shelf life，SL）的預(yù)測模型。

1.3.5 冷卻肉貨架期模型的驗(yàn)證

取新鮮牛肉按照1.3.3節(jié)預(yù)處理后，切成45 塊，隨機(jī)分為3 組，每組15 塊。在復(fù)合保鮮劑中浸泡3 min后瀝干，放入無菌均質(zhì)袋中，分別在2、4 ℃和6 ℃條件下貯藏30 d后，每隔2 d檢測菌落總數(shù)，當(dāng)菌落總數(shù)剛超過106CFU/g時(shí)，此時(shí)為冷卻牛肉實(shí)際貨架期。

1.3.6 指標(biāo)測定

TVB-N含量參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[25]中半微量定氮法測定。

pH值參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測定》[26]進(jìn)行測定。

菌落總數(shù)參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[27]中瓊脂平板計(jì)數(shù)法測定。

感官評(píng)價(jià)參考GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》[28]進(jìn)行，分別對(duì)冷卻牛肉的色澤、氣味和組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分。選擇5 名有感官評(píng)分培訓(xùn)經(jīng)驗(yàn)的人員，按照表2要求進(jìn)行評(píng)分，綜合得分取各項(xiàng)得分的平均值。3 分以下表明冷卻肉已不新鮮或變質(zhì)。

表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table2 Sensory evaluation criteria

1.4 數(shù)據(jù)分析

均勻試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用DPS 7.55軟件中均勻設(shè)計(jì)回歸分析（極小值）進(jìn)行處理分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻牛肉保鮮效果的影響

復(fù)合保鮮劑的配比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。設(shè)Nisin、乳源抗菌肽、茶多酚、丁香精油的添加量分別為X1、X2、X3、X4，TVB-N含量、pH值和菌落總數(shù)分別為Y1、Y2、Y3。對(duì)TVB-N含量、pH值、菌落總數(shù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程、決定系數(shù)和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表4）。根據(jù)表4可知，Y1、Y2回歸方程的R2＞0.99，Y3回歸方程的R2＞0.91，說明回歸方程在本實(shí)驗(yàn)中有意義，回歸方程為分別為：

通過對(duì)回歸系數(shù)的檢驗(yàn)（表4）可知，影響冷卻牛肉TVB-N含量的主次順序是X4＞X2＞X3＞X1，表明丁香精油對(duì)冷卻牛肉TVB-N含量影響最大，其次是乳源抗菌肽，再次是茶多酚，而Nisin的效應(yīng)最小；其中X2、X3、X4影響顯著（P＜0.05），而X1影響不顯著（P＞0.05）。交互作用分析可知，P（X1X2）、P（X1X3）、P（X2X3）和P（X2X4）均小于0.01，說明Nisin與乳源抗菌肽、Nisin與茶多酚、乳源抗菌肽與茶多酚、乳源抗菌肽與丁香精油之間有極顯著的交互作用，P（X1X4）＜0.05說明Nisin與丁香精油之間有顯著的交互作用。典型分析可知：X1＝1.00、X2＝8.00、X3＝1.00、X4＝8.00時(shí)，Y1有最小值，為5.85。將各保鮮劑編碼值換算為添加量，得到復(fù)合保鮮劑的最優(yōu)配比為：Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L。

表4 回歸系數(shù)及變量分析Table4 Regression coefficients and significance test

影響冷卻牛肉pH值的主次順序是X3＞X2＞X4＞X1，表明茶多酚對(duì)冷卻牛肉pH值的影響最大，其次是乳源抗菌肽，再次是丁香精油，而Nisin的效應(yīng)最小；其中X3影響顯著（P＜0.05），而X1、X2、X4影響不顯著（P＞0.05）。P（X1X2）、P（X2X3）和P（X3X4）均小于0.05，說明Nisin與乳源抗菌肽、乳源抗菌肽與茶多酚、茶多酚與丁香精油之間有顯著的交互作用。典型分析可知：X1＝1.00、X2＝8.00、X3＝1.00、X4＝8.00時(shí)，回歸方程Y2有最小值，為5.15。將各保鮮劑編碼值換算為添加量，得到復(fù)合保鮮劑的最優(yōu)配比為：Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L。

影響冷卻牛肉菌落總數(shù)的主次順序?yàn)閄1＞X2＞X3＞X4，表明Nisin對(duì)冷卻牛肉菌落總數(shù)影響最大，其次是乳源抗菌肽，再次是茶多酚，而丁香精油的效應(yīng)最小，其中X1、X2、X3和X4影響均不顯著（P＞0.05），原因可能是殼聚糖的抑菌作用較強(qiáng)[10]，而本實(shí)驗(yàn)中殼聚糖為固定因素。4 種保鮮劑之間交互作用均不顯著（P＞0.05），可能是由于貯藏24 d冷卻牛肉較為新鮮，各試驗(yàn)組菌落總數(shù)均較低，未表現(xiàn)出不同配比復(fù)合保鮮劑對(duì)微生物抑制作用的差異，因而交互作用未表現(xiàn)出來。典型分析可知：X1＝1.00、X2＝8.00、X3＝1.00、X4＝8.00時(shí)，Y3有最小值為3.27。復(fù)合保鮮劑的最優(yōu)配比為：Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L。

由TVB-N含量、pH值和菌落總數(shù)回歸分析可知，Nisin的單因子效應(yīng)最小且不顯著（P＞0.05）。冷卻牛肉貯藏24 d時(shí)TVB-N含量、pH值和菌落總數(shù)均在國標(biāo)要求范圍內(nèi)，此時(shí)冷卻牛肉屬于鮮肉，TVB-N含量決定系數(shù)R2最大（0.999 3），說明TVB-N含量更能反映不同配比的復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻牛肉保鮮能力的差異性，且通過TVB-N含量、pH值和菌落總數(shù)得到的復(fù)合保鮮劑配比相同，為Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L、殼聚糖22.5 g/L。下面實(shí)驗(yàn)均以此復(fù)合保鮮劑配比處理的條件下進(jìn)行。

2.2 復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻牛肉貯藏期內(nèi)品質(zhì)的影響

2.2.1 TVB-N含量

圖1 復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻牛肉TVB-N含量的影響Fig.1 Effect of composite preservative on TVB-N value of chilled beef

TVB-N含量是判斷肉類新鮮度的重要指標(biāo)，它是蛋白質(zhì)經(jīng)酶和細(xì)菌作用后，分解產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮揮發(fā)性物質(zhì)[29]。由圖1可以看出，新鮮牛肉TVB-N含量為6.53 mg/100 g，空白組TVB-N含量在第5天達(dá)到14.69 mg/100 g，接近GB 2707—2016[23]鮮肉標(biāo)準(zhǔn)的15 mg/100 g。復(fù)合保鮮劑處理組在貯藏的前25 d的TVB-N含量增長緩慢，在貯藏25 d后，TVB-N含量快速增加，在第30天時(shí)達(dá)到12.74 mg/100 g，尚未超過GB 2707—2016鮮肉標(biāo)準(zhǔn)，說明復(fù)合保鮮劑能有效延緩TVB-N含量的增加，使貨架期相對(duì)空白組延長25 d以上。

2.2.2 pH值

圖2 復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻牛肉pH值的影響Fig.2 Effect of composite preservative on pH of chilled beef

如圖2所示，冷卻牛肉初始pH值為5.83，空白組pH值在貯藏0～10 d快速升高，第10天時(shí)達(dá)到6.21，超出GB 2707—2016[23]鮮肉標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)合保鮮劑處理組pH值先降低后升高，在第5天時(shí)達(dá)到最低值5.25，隨后緩慢增長，并維持在較低水平（5.3～5.5），與謝晶[30-31]、Pawar[32]等研究結(jié)果相同。pH值的變化是由于死后糖原酵解產(chǎn)生乳酸使pH值不斷下降，隨著貯藏時(shí)間延長，肌肉中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源性酶及微生物的作用下分解，產(chǎn)生堿性氨、胺類化合物或揮發(fā)性堿導(dǎo)致pH值上升[33-35]。說明復(fù)合保鮮劑能明顯抑制冷卻牛肉pH值的升高，有效延長冷卻牛肉的貨架期。

2.2.3 菌落總數(shù)

圖3 復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻牛肉菌落總數(shù)的影響Fig.3 Effect of composite preservative on total viable counts of chilled beef

微生物的生長和繁殖是導(dǎo)致冷卻牛肉變質(zhì)的最主要因素，冷卻牛肉初始菌相中主要微生物是乳酸菌和假單胞菌，二者初始菌落總數(shù)相差不大，但假單胞菌生長速率更高[36]，假單胞菌和熱死環(huán)絲菌是冷卻牛肉的優(yōu)勢腐敗菌[37-38]。由圖3可以看出，初始菌落總數(shù)為4.56（lg（CFU/g）），可能是屠宰、加工和運(yùn)輸過程中未按衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)操作，導(dǎo)致冷卻牛肉表面沾染大量微生物。貯藏期間，空白組菌落總數(shù)不斷增加，在第5天時(shí)已超過106CFU/g，說明初始菌落總數(shù)極大地影響了冷卻牛肉貨架期。復(fù)合保鮮劑具有強(qiáng)效殺菌能力，使冷卻牛肉菌落總數(shù)在0～5 d不斷降低，并對(duì)微生物具有較大抑制作用，延緩了微生物生長遲滯期，使菌落總數(shù)在5～25 d緩慢增加，25～30 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，微生物快速生長，在第30天時(shí)菌落總數(shù)為5.08（lg（CFU/g）），仍未超過GB 2707—2016限量，說明復(fù)合保鮮劑能相對(duì)延長冷卻牛肉貨架期25 d以上。

2.2.4 感官評(píng)分

圖4 復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻牛肉感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of composite preservative on sensory evaluation of chilled beef

貯藏過程中，在微生物作用下冷卻牛肉表面生成黏液，肌肉中蛋白質(zhì)被分解使組織結(jié)構(gòu)變松軟，持水能力下降，分解產(chǎn)生氨及胺類化合物產(chǎn)生異味，進(jìn)而腐敗變質(zhì)，失去食用價(jià)值[39-40]。如圖4所示，空白組感官得分下降速率快，在5 d時(shí)色澤呈褐色，肌肉組織松軟，有異味，感官分值為2.67 分，低于鮮肉標(biāo)準(zhǔn)分值（3 分），10 d時(shí)即色澤暗褐，散發(fā)強(qiáng)烈氨臭味。復(fù)合保鮮劑處理組感官分值下降緩慢，30 d時(shí)感官分值為3.27 分，還能較好保持冷卻肉原有品質(zhì)，感官分值明顯高于空白組，說明復(fù)合保鮮劑能夠有效抑制微生物生長繁殖，阻滯肌肉蛋白質(zhì)分解、脂肪氧化等過程，較好地保持冷卻牛肉感官品質(zhì)，有效延長冷卻牛肉貨架期。

2.3 冷卻牛肉貨架期預(yù)測模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

2.3.1 冷卻牛肉貨架期預(yù)測模型構(gòu)建

圖5 不同貯藏溫度下冷卻牛肉的菌落總數(shù)變化Fig.5 Changes in total viable counts of chilled beef at different storage temperatures

如圖5所示，6 ℃貯藏48 d時(shí)，冷卻菌落總數(shù)已超過106CFU/g，即認(rèn)為樣品已不屬于鮮肉。而-1、2 ℃貯藏54 d時(shí)菌落總數(shù)分別為3.88（lg（CFU/g））和4.55（lg（CFU/g）），表明樣品較為新鮮。

根據(jù)一級(jí)模型方程式（1）對(duì)各溫度條件下菌落總數(shù)隨貯藏時(shí)間變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到不同溫度下微生物生長速率ky值以及決定系數(shù)R2，具體見表5。

表5 冷卻牛肉在不同貯藏溫度下菌落總數(shù)變化的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table5 Kinetic model parameters for total viable counts in chilled beef at different storage temperatures

根據(jù)二級(jí)反應(yīng)模型式（3），以熱力學(xué)溫度的倒數(shù)（1/T）為橫坐標(biāo)，微生物生長速率的對(duì)數(shù)（ln ky）為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到ln ky與1/T的線性關(guān)系如圖6。

圖6 變化速率常數(shù)對(duì)數(shù)與熱力學(xué)溫度倒數(shù)的關(guān)系Fig.6 Linear correlation between ln ky and 1/T

經(jīng)回歸分析得到回歸方程為：y＝-6 567.2x+19.991，回歸系數(shù)R2＝0.991 6，說明此回歸方程在所選溫度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)式（3）結(jié)合回歸方程的斜率值和截距值，計(jì)算得出k0＝4.81×108d-1，-EA/R＝-6 567.2 K，y0＝1.6（lg（CFU/g））。將k0、-EA/R、y0值帶入式（4）得到冷卻牛肉貨架期預(yù)測模型（式（5））。

由于GB 2707—2016[23]規(guī)定鮮肉菌落總數(shù)不超過106CFU/g，即y＝6，將其代入式（5）可得-1～6 ℃貯藏條件下冷卻牛肉貨架期預(yù)測模型，見式（6）。

2.3.2 冷卻牛肉貨架期預(yù)測模型驗(yàn)證

為評(píng)價(jià)所構(gòu)建的-1～6 ℃貯藏條件下冷卻牛肉貨架期預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，將經(jīng)過復(fù)合保鮮劑處理過的冷卻牛肉，在2、4 ℃和6 ℃條件下貯藏，測定冷卻牛肉實(shí)際貨架期，與通過貨架期模型所得預(yù)測值進(jìn)行比較，以相對(duì)誤差為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證貨架期模型的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表6。

表6 冷卻牛肉在2、4 ℃和6 ℃貯藏條件下貨架期的預(yù)測值和實(shí)測值Table6 Predicted and observed shelf life of chilled beef stored at 2, 4 or 6 ℃

由表6可知，通過貨架期預(yù)測模型得到的2、4、6 ℃貯藏溫度下貨架期預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)得到的貨架期實(shí)測值的相對(duì)誤差分別為5.98%、2.66%、-2.37%，均小于6%，說明此模型可以快速、準(zhǔn)確、有效地預(yù)測經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理過的冷卻牛肉的貨架期。

3 討 論

冷卻肉的腐敗變質(zhì)是內(nèi)源性酶、微生物以及各種理化反應(yīng)共同作用的結(jié)果，其中微生物的生長繁殖對(duì)冷卻肉理化和感官品質(zhì)影響最大，初始菌落總數(shù)和貯藏溫度直接影響冷卻肉貨架期[41]。天然保鮮劑綠色安全且抗菌性強(qiáng)，但單獨(dú)使用時(shí)存在抑菌譜窄的問題，不能有效抑制某些微生物的生長繁殖，而多種天然保鮮劑復(fù)合使抑菌譜得到擴(kuò)大[42]，并具備抗氧化的作用[43]，對(duì)保持冷卻肉色澤具有重要作用[44]，利用保鮮劑之間的協(xié)同作用，不僅降低了各保鮮劑使用劑量，而且增強(qiáng)了抑菌效果[45]。He Li等[46]研究發(fā)現(xiàn)，采用Nisin（0.625 g/L）、茶多酚（0.313 g/L）和殼聚糖（3.752 g/L）復(fù)合保鮮劑處理冷卻羊肉能有效抑制其在4 ℃貯藏過程中腐敗微生物和病原菌的生長，使冷卻羊肉貨架期從6 d延長至18 d。章薇等[47]研究了Nisin（0.25 g/L）、茶多酚（0.5 g/L）、香辛料提取物（20.0 g/L）和抗壞血酸（0.2 g/L）復(fù)合保鮮劑對(duì)冷卻雞肉保鮮效果的影響，研究表明，復(fù)合保鮮劑可使4 ℃條件下冷卻雞肉貨架期由7 d延長至21 d。Qin Yuyue等[48]研究了殼聚糖（10.0 g/L）和不同濃度茶多酚復(fù)合，通過脫氣和干燥處理制成復(fù)合膜對(duì)4 ℃貯藏條件下豬肉糜的保鮮效果，研究表明，復(fù)合膜可有效減緩脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和高鐵肌紅蛋白含量的增加，相比于對(duì)照組，該復(fù)合膜可使貨架期延長6 d。研究表明冷卻肉初始菌落總數(shù)對(duì)產(chǎn)品貨架期影響顯著[3]，本實(shí)驗(yàn)所用乳源抗菌肽復(fù)合保鮮劑處理冷卻牛肉后，可明顯降低冷卻牛肉初始菌落總數(shù)，并在冷卻牛肉表面形成一層膜，阻止微生物的侵染。冷卻牛肉在冷藏過程中持水性的下降導(dǎo)致水分析出，水分從冷卻牛肉表面滲出過程中會(huì)附帶將肉表面的復(fù)合保鮮劑溶解，使得肉表面覆蓋的復(fù)合保鮮劑膜破裂損失，當(dāng)肉浸泡在含有復(fù)合保鮮劑的汁液中時(shí)，由于濃度梯度的存在，可能加速肉中水分的析出，這一過程可能影響復(fù)合保鮮劑的保鮮效果。

食品貨架期預(yù)測模型主要有BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、威布爾危險(xiǎn)值分析、Q10模型以及基于微生物生長動(dòng)力學(xué)的一、二、三級(jí)模型[49]。冷卻肉貨架期預(yù)測模型的獲得，一般通過測定自然污染或接種特定微生物的原料肉的菌數(shù)變化來建立模型[50]，常使用的一級(jí)模型主要有對(duì)數(shù)模型、Logistic模型、Baranyi模型和Gompertz方程等，二級(jí)模型主要有平方根模型、Arrhenius方程和響應(yīng)面模型等[51]。冷卻肉的腐敗變質(zhì)主要由微生物生長繁殖造成，貯藏溫度和菌落總數(shù)的變化與冷卻肉貨架期密切相關(guān)；因此，通常使用菌落總數(shù)或特定腐敗菌為指標(biāo)建立貨架期預(yù)測模型。董慶利等[50]研究采用修正的Gompertz方程和平方根模型，對(duì)豬肉中接種的氣單胞菌的生長進(jìn)行預(yù)測，建立了0～20 ℃貯藏溫度下冷卻豬肉貨架期預(yù)測模型，相對(duì)誤差小，模型具有較好可靠性。宋晨等[52]研究采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Arrhenius方程，以菌落總數(shù)為指標(biāo)，建立了-25～25 ℃貯藏溫度下冷凍羊肉貨架期預(yù)測模型，該模型預(yù)測準(zhǔn)確性高。馬妍等[53]通過一級(jí)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型和Arrhenius方程建立了0～8 ℃貯藏溫度下河豚魚貨架期預(yù)測模型，結(jié)果表明該模型對(duì)菌落總數(shù)和TVB-N含量變化具有較高擬合度，貨架期預(yù)測準(zhǔn)確率高。本研究使用自然污染的冷卻牛肉來建立貨架期模型，原料肉初始菌落總數(shù)為2.63（lg（CFU/g）），經(jīng)過復(fù)合保鮮劑浸泡3 min后，菌落總數(shù)降為1.60（lg（CFU/g）），因而較低的初始菌落總數(shù)使冷卻牛肉貨架期得到極大延長，4 ℃貯藏條件下冷卻牛肉貨架期可達(dá)53 d。對(duì)貨架期預(yù)測模型的使用時(shí)需要注意使用條件，冷卻牛肉須經(jīng)過乳源抗菌肽復(fù)合保鮮劑處理，并在-1～6 ℃溫度范圍內(nèi)貯藏，如果超出此溫度范圍，該預(yù)測模型可能不具有較好的符合度。

在下一步的研究中，將考慮研究天然復(fù)合保鮮劑結(jié)合冰溫貯藏對(duì)冷卻肉持水性的影響，并通過氣調(diào)包裝控制貯藏過程中氣體環(huán)境，抑制微生物生長繁殖，控制蛋白質(zhì)、脂肪氧化，利用低場核磁共振技術(shù)[54-55]研究復(fù)合保鮮劑處理對(duì)貯藏過程中冷卻牛肉水分分布、移動(dòng)性和肌肉結(jié)構(gòu)變化的影響，從而進(jìn)一步延長冷卻肉貨架期并保持良好感官品質(zhì)。

4 結(jié) 論

冷卻牛肉復(fù)合保鮮劑配比為乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L、殼聚糖22.5 g/L和Nisin 0.15 g/L，（4±1）℃條件下冷卻牛肉貨架期比空白組延長25 d以上。Nisin與乳源抗菌肽、Nisin與茶多酚、Nisin與丁香精油、乳源抗菌肽與茶多酚、乳源抗菌肽與丁香精油之間對(duì)冷卻肉TVB-N含量有顯著的交互作用（P＜0.05）。Nisin與乳源抗菌肽、乳源抗菌肽與茶多酚、茶多酚與丁香精油之間對(duì)冷卻保鮮肉pH值有顯著的交互作用（P＜0.05）。單因素分析表明丁香精油對(duì)冷卻牛肉TVB-N含量影響最大，其次是乳源抗菌肽，再次是茶多酚，而Nisin的影響最小。

使用乳源抗菌肽復(fù)合保鮮劑處理冷卻牛肉，構(gòu)建了-1～6 ℃范圍內(nèi)冷卻牛肉的貨架期預(yù)測模型，為SL＝2.75×10-9×exp（6 567.2/T），對(duì)該貨架期模型進(jìn)行預(yù)測值和實(shí)測值驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其相對(duì)誤差均在6%以內(nèi)，說明在-1～6 ℃的范圍內(nèi)該模型能夠準(zhǔn)確、有效地預(yù)測冷卻牛肉貨架期。綜上所述，天然復(fù)合保鮮劑可有效維持冷卻牛肉感官品質(zhì)，延長其貨架期，通過貨架期模型可判斷冷卻牛肉腐敗程度，從而達(dá)到降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)、減少經(jīng)濟(jì)損失、控制冷卻肉安全性的目的。