低溫休眠預處理對花鱸無水保活效果的影響

張玉晗，謝 晶*

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術中心，上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

花鱸（Lateolabrax maculatus）是我國主要的養殖海水魚品種之一。每年10～11月份養殖鱸魚開始大量上市，其中以鮮活花鱸價格最高、市場行情最好[1]；因此有必要實現花鱸由養殖基地到銷售市場的保活運輸。采用生態冰溫無水活運法運輸花鱸的研究目前鮮見報道，如能成功運用這項技術則可以顯著降低花鱸運輸成本，并加大運輸量、擴大活魚銷售范圍[2]。

生態冰溫無水活運法運輸活魚的過程中，人工操作（捕撈、降溫、包裝、搬運、運輸）會導致魚產生一系列應激行為，造成魚生理指標變化，甚至魚體體表及組織產生損傷[3-4]。溫度可對魚類代謝反應起控制作用，從而影響魚體生理生化變化[5]。肝組織是魚體產生應激反應的主要器官，表現為肝細胞凋亡、細胞結構破壞、細胞質外流等[6]。細胞凋亡是指機體在一定的自身或外界條件刺激下，細胞為維護機體而結束自身活性的過程。細胞凋亡受到半胱氨酸蛋白酶家族嚴格調控；因此，檢測細胞凋亡酶活性變化可反映魚體組織的受損傷程度[6-11]。在正常情況下，半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase）處于非活化的酶原狀態，凋亡程序被觸發后酶活性明顯升高，隨后發生凋亡蛋白酶的層疊級聯反應；其中，Caspase-3最后被激活，它是細胞凋亡的執行者[8]。魚前蛋白轉化酶枯草溶菌素前蛋白轉化酶枯草溶菌素-9（protein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK-9）是層疊級聯反應中的一員，參與細胞凋亡，同時，還可影響魚體細胞周期、炎癥和應激反應等[10]。采用生態冰溫無水活運活魚必須經歷從常溫開始的降溫過程，而降溫速率是影響活魚無水保活運輸成活率的關鍵因素；鑒于此，本實驗通過對花鱸肝組織Caspase-3活力、丙二醛（malonaldehyde，MDA）濃度、血清中PCSK-9、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活力變化研究，探討無水運輸過程中不同降溫速率對花鱸肝組織造成的影響，為其保活運輸工藝的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花鱸購自上海當地水產品市場。挑選體質健康、無外傷、鱗片完整、大小基本一致（長約40 cm）的活花鱸作為實驗材料。

實驗用水由經顆粒活性炭過濾后曝氣的自來水和海鹽配制而成，實驗開始前1 d配制，連續曝氣24 h后用于實驗。水溫22～23 ℃、鹽質量分數1.6%～1.7%、溶解氧質量濃度4～6 mg/L、pH 7.5～8.5[10]。

Caspase-3活力檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、PCSK-9酶聯免疫吸附檢測試劑盒及AST、ALT檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

全自動循環冷水機 廣東海利集團；LX-100VTR模擬運輸振動臺 上海魯軒儀器設備廠；SH-1000Lab-全波長酶標儀 北京宏昌信科技有限公司；F2640型多點溫度采集儀 美國Fluke公司；5810R高速冷凍離心機上海艾測電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

在養殖池（密度：20 尾/m3）中進行周期饑餓馴化[12]，喂食1 d饑餓3 d（持續2 個周期），早晚各喂食1 次，投喂魚體質量10%的飼料[13]，并接受日常光照；第3周期饑餓開始的第1天將花鱸食物誘捕（單條捕撈）進暫養箱（密度：1 尾/50 L），禁食暫養6 h[14-15]；再對魚進行冷馴化（冷水機分別按照1、3、5 ℃/h降溫速率將暫養箱中水溫從22～23 ℃降至臨界溫度4 ℃）對魚進行冷馴化[16-18]（此時魚體呼吸頻率（24±3）次/min，魚體表現為失去平衡、魚腹朝上、裂鰓、應激反應遲鈍、呼吸極不規律）。在冷馴化過程中，隨著水溫降低，魚呼吸速率明顯減慢，在觸及反應十分微弱后撈出，放于泡沫箱（23 cm×45 cm×13 cm）內的濕木屑上（4 ℃、鹽質量分數1.6%～1.7%的水潤濕1 h后瀝干），然后裝入塑料袋內（1 箱/袋），將塑料袋內空氣排出，放入CO2吸收藥包、冰袋（不與魚接觸）后充入氧氣，扎緊袋口后，放入振動臺上大保溫箱內[19-20]。

1.3.2 模擬汽車中長途公路運輸

振動臺上進行室內模擬運輸實驗；運輸過程：B級路面（80 km/h）1 h→A級路面（100 km/h）5 h→B級路面（80 km/h）2 h；運輸總時間8 h（運輸時間由預實驗確定）；總路程740 km[21]。模擬運輸8 h結束后，打開包裝，取出魚，放入22～23 ℃養殖水溫中直接喚醒。

本實驗是通過物理降溫的方式誘導花鱸休眠，以達到無水保活的目的。實驗共分為3組，每組樣品30 條。花鱸生理指標檢測時間點為：運輸開始0 h、運輸1 h、運輸2 h、運輸8 h、8 h喚醒后；每個測試點隨機選取3 尾魚進行指標測試；以養殖池中饑餓馴化過，未經降溫、運輸操作的花鱸為對照組（CK組）；每組剩余10 尾用于記錄花鱸運輸后各降溫速率處理組的喚醒時間，以及喚醒后8 h和1、2 d時的死亡率。

1.3.3 指標測定

花鱸經木棒敲擊致死，稱質量和量體長后，采用1 mL一次性醫用注射器（預先用10 mg/mL肝素鈉溶液潤洗）尾部靜脈取血，采取的血樣在4 ℃冰箱放置2 h后，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，上清液即為制備的血清；取血后的魚置于冰盤上，解剖出魚肝臟，血清和肝臟均迅速存放于-80 ℃冰箱。

1.3.3.1 肝組織中Caspase-3活力、MDA濃度的測定

分別采用Caspase-3活力檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒測定肝組織勻漿中的Caspase-3活力/（U/L）和MDA濃度/（nmol/L）。

1.3.3.2 血清中PCSK-9、AST、ALT活力的測定

采用PCSK-9酶聯免疫吸附檢測試劑盒和AST、ALT檢測試劑盒分別測定血清中PCSK-9、AST、ALT活力，單位為U/L。

1.4 數據處理

應用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行統計分析，結果以表示，Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 降溫速率對花鱸無水活運過程中肝組織Caspase-3活力的影響

細胞凋亡檢測是組織發生損傷時的常規檢測。Caspase-3在細胞受到刺激、損傷或接到死亡信號指令等信號時被激活，活化的Caspase-3可通過水解特異性蛋白底物從多方面促進細胞凋亡的發生，是凋亡的關鍵執行者[22-25]。CK組Caspase-3活力為（1.44±0.17）U/L。如圖1所示，與CK組相比，各降溫速率處理組在運輸0 h時，肝組織中Caspase-3活力明顯升高（P＜0.05），且不同降溫速率處理組之間差異明顯。隨著運輸時間的延長，3 個不同降溫速率組的Caspase-3活力不斷增強，運輸結束后Caspase-3活力呈下降趨勢，說明運輸8 h喚醒后花鱸肝組織細胞凋亡現象減弱。降溫結束后（運輸0 h），1 ℃/h降溫處理組Caspase-3活力顯著高于3、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），這是可能是由于降溫處理時間過長，環境刺激肝組織細胞，導致Caspase-3活力強。3 ℃/h降溫處理組Caspase-3活力顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），這可能是由于3 ℃/h降溫速率有效地降低了魚體的氧化應激，因氧化應激誘導的細胞凋亡減少，Caspase-3活力降低。徐瑾等[26]研究發現，超低溫保存中的氧化應激不僅可以直接造成細胞損傷，也可誘導細胞凋亡。5 ℃/h降溫處理組Caspase-3活力低于1 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），可能是由于該組降溫速率快，處理時間短，低溫抑制了Caspase-3活力。由此可知降溫速率慢會導致Caspase-3活力升高，從而引起肝組織細胞發生凋亡。

圖1 降溫速率對花鱸無水活運過程中肝組織Caspase-3活力的影響Fig.1 Effect of cooling rate on caspase-3 activity in liver tissue of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

2.2 降溫速率對花鱸無水活運過程中肝組織MDA濃度的影響

圖2 降溫速率對花鱸無水活運過程中肝組織MDA濃度的影響Fig.2 Effect of cooling rate on MDA concentration in liver tissue of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

在運輸環境下，魚類會產生過量的氧自由基，引起脂類、蛋白質和核酸等大分子過氧化，其中脂質過氧化對機體的損傷最大，脂質過氧化產生的MDA等物質會破壞生物體細胞結構和功能。肝臟是魚體抗氧化反應的主要器官，肝組織氧自由基生成增多是誘導凋亡發生的重要原因。有研究表明，肝組織內MDA含量與肝實質細胞凋亡數量有顯著的正相關關系[27]。CK組MDA濃度為（8.38±0.73）nmol/L。如圖2所示，降溫結束后，3 個不同降溫速率組的MDA濃度增加，且隨著運輸時間的延長，MDA濃度不斷增加，運輸結束后，喚醒過程使MDA濃度下降（P＜0.05）。運輸過程中3 ℃/h降溫處理組肝組織內MDA濃度顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），這表明3 ℃/h降溫有效降低了魚體的氧化應激。不同降溫速率導致無水活運過程中花鱸肝組織產生劇烈脂質過氧化，造成肝組織細胞大量凋亡與損傷，這可能也是花鱸無法長時間活運的主要原因。與運輸8 h比較，喚醒后花鱸的肝組織內MDA濃度呈下降趨勢，但依然很高，表明無水活運過程對花鱸肝臟的損傷是不可逆的。

2.3 降溫速率對花鱸無水活運過程中血清PCSK-9活力的影響

圖3 降溫速率對花鱸無水活運過程中血清PCSK-9活力的影響Fig.3 Effect of cooling rate on serum PCSK-9 activity of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

PCSK-9可進入體循環影響血脂水平，還可參與細胞的凋亡[28-29]。研究發現PCSK-9被激活后，細胞凋亡率也有所升高，其機制可能是通過切割Caspase-3前體，從而激活Caspase-3的活力，發揮促使細胞凋亡的作用[30-34]。CK組PCSK-9活力為（0.095±0.570）U/L。如圖3所示，運輸0 h時，3 個降溫速率處理組花鱸肝組織Caspase-3活力較CK組均增高，且5 ℃/h降溫處理組花鱸血清中PCSK-9活力顯著低于1、3 ℃/h降溫處理組（P＜0.05）；這可能是由于降溫速率快，溫差大抑制了花鱸血清中PCSK-9活力。運輸2 h，3 ℃/h降溫處理組花鱸血清中PCSK-9活力顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），5 ℃/h降溫處理組呈現驟然增高的值，同時偏差較大，不排除取樣時魚體樣本自身原因；PCSK-9參與了花鱸的細胞凋亡，這個過程中通過消耗PCSK-9激活Caspase-3的活力，故而血清中PCSK-9活力在運輸過程中呈現較低水平。運輸8 h后，喚醒階段3、5 ℃/h降溫處理組花鱸血清中PCSK-9活力明顯增高，這可能是由于運輸結束后使用常溫養殖水直接喚醒，再次誘發了魚體產生應激。

2.4 降溫速率對花鱸無水活運過程中血清AST、ALT活力的影響

圖4 降溫速率對花鱸無水活運過程中血清AST（A）、ALT（B）活力的影響Fig.4 Effect of cooling rate on serum AST (A) and ALT (B) activity of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water

正常情況下花鱸血清中AST、ALT活力很低而且含量相對穩定，但當肝臟受到損傷時血清中AST、ALT活力會升高，故血清中AST、ALT活力可以反映肝細胞損傷和代謝程度，被用來作為確認肝功能是否損傷的最具特異性并廣泛使用的指標[35]。CK組AST、ALT活力分別為（92.19±3.23）、（53.29±2.46）U/L。如圖4A、B所示，運輸0 h時，1、3、5 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST、ALT活力明顯高于CK組，表明降溫會對魚體的肝臟造成損傷。何蓉等[36]研究不同溫度無水活運中華鱉，發現低溫造成AST活力升高，且隨運輸時間延長，AST活力有所下降，與本研究結果相一致。3 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST、ALT活力明顯低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），表明3 ℃/h降溫時，因降溫處理時間短、溫差小能夠適當緩解花鱸因為運輸操作造成的肝臟損傷。運輸8 h的過程中，3 組花鱸血清中AST、ALT活力均呈升高趨勢，其中運輸8 h和喚醒處理后，1 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST、ALT活力均顯著低于5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），且5 ℃/h降溫處理組ALT活力升高速度快（P＜0.05），表明降溫速率快會導致魚體肝臟組織受損加重。運輸8 h后，喚醒過程中3 ℃/h降溫處理組花鱸血清中AST活力較運輸過程中的增長減緩（P＜0.05），5 ℃/h降溫速率處理組ALT活力降低，1 ℃/h降溫速率處理組AST、ALT活力仍較高。這可能是由于長時間低溫無水環境，機體代謝逐漸以無氧呼吸為主，體內抗氧化系統出現問題，導致“喚醒”后的花鱸肝臟恢復緩慢或已產生不可修復的損傷。

2.5 不同降溫速率對花鱸無水活運后死亡率的影響

將生態冰溫無水活運法運輸后的花鱸直接放入常溫（22～23 ℃）水中，可以觀察到魚尾擺動幅度越來越大，魚鰓開始不規律地開閉，呼吸頻率越來越大，逐漸接近正常水平，過程大約需20 min左右（1、3、5 ℃/h降溫處理并無水活運后花鱸喚醒時間分別為19、1 min和16 min）（表1），魚體恢復正常的游動。

表1 喚醒后時間對不同降溫速率處理組無水活運花鱸死亡率的影響Table1 Mortality rate of Lateolabrax maculatus with precooling treatment at different cooling rates%

各組花鱸在常溫水中喚醒8 h后均出現死魚現象，如表1所示，1 ℃/h降溫處理組花鱸在運輸后1 d死亡率就高達50%，2 d死亡率達到70%；隨著喚醒后時間的延長，1 ℃/h降溫處理組花鱸死亡率不斷升高，3 ℃/h降溫處理組花鱸死亡率在3 個降溫處理組中最低，但與業界期望值還有差距。這可能是本實驗操作“喚醒”步驟時采用了常溫快速喚醒，花鱸已經過降溫、包裝、運輸過程中的應激，體內能量已不足，免疫系統紊亂，適應環境能力差，將此時的花鱸放入與之前運輸箱內環境差異較大的地方，導致花鱸再次應激，因而死亡率高。

3 結 論

花鱸可以通過低溫誘導休眠的方式進行無水保活，無水活運8 h，常溫喚醒后魚體可回到正常狀態并存活一段時間，這項技術可用于花鱸一定距離的無水活運。運輸0 h，1、3、5 ℃/h 3個降溫速率處理組的花鱸肝組織Caspase-3活力、MDA濃度及血清中PCSK-9、AST、ALT活力指標數值較CK組均增高，運輸結束后，喚醒過程使Caspase-3活力和MDA濃度下降，PCSK-9活力增高，ALT活力增加減緩或降低。1 ℃/h降溫處理組花鱸喚醒時間長，喚醒后2 d死亡率達到70%，不利于實現保活運輸價值。3 ℃/h降溫處理組肝組織中Caspase-3活力、MDA濃度和血清中ALT、AST活力、養殖水喚醒后死亡率顯著低于1、5 ℃/h降溫處理組（P＜0.05），且顯著高于CK組（P＜0.05）；因此3 ℃/h降溫處理后無水活運對花鱸肝組織損害低。

建議將花鱸通過低溫誘導休眠的方式進行無水保活的降溫速率設定為3 ℃/h，同時建議今后可在暫養密度、包裝條件尤其是“喚醒”工藝等參數優化方面開展進一步深入研究，提高運輸后的存活率。目前研發的生態冰溫無水活運法可用于中短途花鱸的保活運輸。