基于不同識別元件的表面等離子體共振技術在食品安全檢測中的研究進展

顏朦朦，佘永新,*，洪思慧，張 超，曹曉林，王猛強，王珊珊，鄭鷺飛，金茂俊，邵 華，金 芬，劉海金，王 靜,*

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；2.西藏自治區農畜產品質量安全檢驗檢測中心，西藏 拉薩 850009）

隨著社會的發展、科技的進步，食品安全問題越來越受到重視，其安全因素（農藥、獸藥、生物毒素、微生物等）[1-2]引發的安全事件屢見不鮮；因此為保證食品安全并滿足人們的需求就必須進行監管監測，多種檢測方法已得到應用，如氣相色譜-質譜聯用技術[3-4]、高效液相色譜[5]、液相色譜-質譜聯用技術[6]等儀器檢測法，這些技術雖然靈敏且精確，但是花費時間長、需要專業的培訓以及昂貴的儀器。其中也包括相對簡單快捷的檢測技術，如免疫學方法（酶聯免疫反應分析技術[7]等），但其使用的生物材料都比較昂貴，并且需要繁瑣的洗滌步驟，耗費大量試劑，對環境造成污染。因此，一種簡單、快速、準確的檢測技術需要應用到食品安全檢測中。

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術是利用金屬薄膜光學耦合產生的物理光學現象檢測物質的技術，自1902年由Wood發現，至今已有100多年的歷史。其具體原理如下：當一束偏振光在一定的角度范圍內入射到棱鏡端面，在棱鏡與金屬薄膜（Au或Ag）的界面將產生表面等離子波，當入射光的傳播常數與表面等離子波的傳播常數相匹配時，引起金屬膜內自由電子產生共振，即SPR[8]。分析時，先在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金屬表面折射率變化，最終導致SPR角度的變化，通過檢測SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學常數和特異性等信息。SPR技術具有靈敏度高、操作簡單、能夠實時監測反應的動態過程，只需對樣品進行簡單的預處理，無需標記，耗樣量少，檢測時間短等[9-11]優點，已被廣泛應用于各個研究領域，如生命科學[12-13]、醫藥學[14-15]、環境監測[16-17]等，并逐漸應用到食品安全[18-19]檢測中。其中SPR傳感器中的分子識別元件是其重要組成部分，它決定檢測方法的特異性，本文主要從不同種類的識別元件技術簡要綜述近10 年來SPR傳感器技術在食品安全檢測中的應用。

1 識別元件

1.1 抗體

利用抗體作為識別分子檢測農藥是目前世界上應用最廣、最普遍的檢測方法。隨著科技的發展，此識別分子更廣泛地應用到農藥的檢測，并且其檢測限不斷降低，檢測范圍不斷增大，本文總結了近幾年的研究文獻（表1），其傳統的檢測方法主要包括競爭法、直接法及夾心法。

表1 基于抗體識別元件的SPR傳感器在農產品檢測中的應用Table1 Applications of SPR sensors based on antibody recognition elements in agricultural product detection

競爭法是指先在SPR傳感器芯片上固定半抗原-蛋白復合物，然后加入靶標及固定濃度的抗體混合液，競爭法是半抗原與靶標同時競爭抗體的方法，當靶標濃度升高時，金屬表面的抗原-抗體濃度就減小，SPR響應信號強度相應減小，靶標濃度與SPR信號強度成反比，是農藥檢測中最常用的方法（圖1）。如2007年Mauriz等[20]利用競爭法同時檢測雙對氯苯基三氯乙烷（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）、西維因、毒死睥3 種農藥，并且都能達到較低檢測限，分別為18 ng/L、0.05 μg/L、52 ng/L。夾心法是將抗體首先固定在芯片表面，然后加入抗原，與抗體結合，然后再加入二抗，以增加SPR的響應信號強度，靶標濃度與SPR信號強度成正比，此方法在農藥檢測中的應用較少。在2001年Shimomura等[21]利用夾心法進行了阿特拉津的檢測，在5 ng/mL的阿特拉津樣品中檢測到信號放大比率為1.9（圖2）；類似的，Wu Xuli等[22]通過SPR分別以5.54 ng/mL和0.77 ng/mL的檢測限同時檢測牛奶和花生中過敏原：β-乳球蛋白及花生蛋白Ara h1。Ashley等[23]采用了由4 個感測陣列組成的SPR傳感器芯片，傳感器芯片使用EDC/NHS偶聯方法固定α-酪蛋白多克隆抗體。首先優化和測定傳感器的性能，并在純緩沖液條件下進行表征，得到作為直接結合測定的檢測限為58 ng/mL。通過使用夾心測定形式并用納米顆粒信號增強，應該可以進一步提高測定靈敏度，但是在此傳感器上并沒有達到增加靈敏度的效果。傳感器表現出對α-酪蛋白的良好選擇性，并且獲得了足夠的回收率。直接檢測法主要應用在大分子上，Yakes等[24]在SPR芯片上固定單克隆抗體，其檢測通道分為單通道及多通道（可以同時檢測96 個樣品），并且與成熟的酶聯免疫檢測方法相比較，3 種方法同時檢測貝類組織的多糖酸，多通道原型儀器于2 h內完成，單通道為12 h，酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）為24 h以上，很好地提高了工作效率。類似的，Zhang Xiaoguang等[25]通過直接固定抗體在芯片上實現了對大腸桿菌、沙門氏菌和李斯特菌的同時檢測。為了實現現場快速檢測，Pan Qi等[26]構建了便攜式掃描SPR生物傳感器，用于食品的安全檢測，并用瘦肉精作為樣品，該方法和裝置的有效性通過了實驗證明。

圖1 競爭法簡易原理圖Fig.1 Schematic diagram of the competitive method

圖2 夾心法簡易原理圖[21]Fig.2 Schematic diagram of the sandwich method[21]

隨著納米材料的發展，其也應用到SPR傳感器中，它可以有效地增強SPR響應信號，提高對靶標檢測的靈敏度。Yan Fufeng等[27]通過羧基改性石墨烯，實現了鹽酸克倫特羅的高靈敏度檢測。首先將山羊抗小鼠抗體與1-十八烷硫醇（1-octadecanethiol，OTD）改性的羧基-石墨烯綴合，然后通過自組裝沉積在OTD改性的金表面上，原理如圖3所示。為了了解這3 種方法的優劣，Charlermroj等[28]以瓜氨酸為模型，并且將羧甲基化傳感器芯片C1及羧甲基化葡聚糖芯片CM5進行了比較，結果表明C1BI C5有更好的靈敏度，同時，直接檢測法表現出最佳的靈敏度，最后對西瓜進行了實際樣品分析，得到較好的回收率。Liu Xia等[29]將Fe3O4磁性納米粒子固定在芯片表面并且其表面用羧基基團進行修飾，以利于納米粒子與靶標抗體的結合，然后引入靶標，靶標結合到納米粒子表面的抗體上，此時由于納米粒子的存在，SPR信號在同種靶標濃度下的信號將會增強，從而達到提高檢測限的目的，利用該技術對溴氰菊酯進行了檢測，檢測限可以達到0.01 ng/mL。另外此帶有抗體的磁性納米粒子還可以對含有溴氰菊酯復雜的農產品或食品樣品進行靶標的純化與富集，從而提高檢測的精確度。2017年，Daems等[30]首次使用自動光纖（fiber optic，FO）-SPR生物傳感器，在復雜生物樣品中量化小分子（如黃體激素）。其原理如圖4所示，從FO-SPR生物傳感器（A）開始，通過活化的羧基將孕酮-牛血清白蛋白（P4-bovine serum albumin，P4-BSA）共價固定在具有羧基的金涂層纖維的表面上（B），溶液中的游離P4和FO-SPR傳感器上固定的P4-BSA競爭檢測抗體（抗P4）。該信號由用山羊抗小鼠抗體功能化的Au納米顆粒（nanoparticle，NP）增強。此外，開發的生物測定法與商業化ELISA法比較，顯示出良好的一致性。利用相同原理，Hu Weihua等[31]實現了對黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮3 種典型霉菌毒素的高度特異性和靈敏度同時檢測，檢測限分別為8、30、15 pg/mL。

圖3 基于功能化石墨烯的SPR芯片簡易圖[27]Fig.3 Schematic diagram of SPR chip based on functionalized grapheme[27]

圖4 FO-SPR生物測定的概述圖[30]Fig.4 Schematic diagram of FO-SPR[30]

1.2 適配體

適配體（aptamer，Apt）是具有30～40 個核堿基的短寡核苷酸（RNA或單鏈DNA（ssDNA）），不需要動物或細胞培養，具有靶標-寡核苷酸的結合特異性。適配體對其靶標具有高親和力，其解離常數（Kd）在nmol～pmol范圍[49]。此外，通常適配體折疊成獨特的三維結構，其允許特異性結合靶向分析物，因此適配體通過互補形式而不是其序列與靶標相互作用。適配體具有許多優點，例如它們具有很好的熱穩定性并可重復使用，并且它們可以容易地通過引入功能分子（例如熒光團或酶）和官能團而被修飾[50]。這種化學修飾可以增強目標分析物的穩定性、親和性、特異性和功能性。此外，其具有優于抗體的多功能性和避免動物在其生產中使用的特點，并且還具有較高的受體表面密度。因此，適配體在生物傳感器中作為識別元件已得到廣泛的應用。使用者可以結合各種目標分析物，如毒素[51]、抗生素[52]和生物標志物[53]等，近年來基于適配體的SPR傳感器在食品安全檢測中也逐漸被應用（表2）。2015年，Zhu Zhiling等[54]報道了基于適配體的SPR傳感器，將其用于赭曲霉毒素A的快速、準確、高靈敏度檢測，將鏈霉親和素作為交聯劑固定在傳感器芯片的表面上，并通過鏈霉親和素-生物素相互作用捕獲生物素適配體，然后適配體捕獲靶標分子，從而達到檢測的目的，該傳感器的檢測范圍為0.094～100.000 ng/mL，檢測限為0.005 ng/mL，通過簡單的液-液萃取樣品前處理方式檢測葡萄酒和花生油中的赭曲霉毒素A，添加回收率為86.9%～116.5%，變異系數為0.2%～6.9%。同理，Janardhanan等[55]用RNA適配體進行肉毒桿菌神經毒素的檢測，使用解毒重組型A型肉毒桿菌神經毒素作為替代物，用適配體傳感器在90 min內檢測活性毒素，磷酸鹽緩沖液、胡蘿卜汁和無脂牛奶中的檢測限分別為5.8、20.3 ng/mL和23.4 ng/mL，5 倍稀釋的人血清中的檢測限為22.5 ng/mL。為了提高檢測靈敏度，Lei Pinhua等[56]將改進的不對稱聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術整合到SPR傳感器芯片的表面中，其原理如圖5所示，首先用硫醇化探針對傳感器的金膜進行修飾，然后誘導靶序列和信號放大單元的鏈霉親和素適配體形成夾層結構，如果添加沙門氏菌，則SA適配體與SA形成復合物，然后通過PCR技術實現信號放大，從而達到提高檢測靈敏度的目的。與以上原理不同的是，Tran等[57]利用膠體金顆粒實現信號放大（圖6），首先將所選擇的適配體固定在芯片上。然后，將FO-SPR傳感器浸入具有多克隆二抗的緩沖液中，形成三明治夾心結構。在這些抗體與花生過敏原Ara h1蛋白結合后，將FO-SPR探針浸入含有被蛋白A修飾的Au NPs的溶液中，蛋白A是對抗體的FC部分具有高親和力，在該測定中應用Au NPs以進一步增強信號。

表2 基于適配體識別元件的SPR傳感器在農產品檢測中的應用Table2 Applications of SPR sensors based on aptamer recognition elements in agricultural product detection

圖5 基于PCR信號放大的SPR原理示意圖[56]Fig.5 Schematic diagram of signal amplification of SPR based on PCR[56]

圖6 基于AuNPs信號放大的SPR原理示意圖[57]Fig.6 Schematic diagram of signal amplification of SPR based on AuNPs[57]

1.3 分子印跡聚合物

分子印跡聚合物（molecular imprinting polymer，MIP）是以目標分子為模板分子（原子、離子、分子、復合物、大分子以及微生物等），將具有結構上互補的功能化聚合物單體通過某種作用力（非共價作用、電子或離子作用、共價作用以及金屬配位作用等）與模板分子結合，并加入交聯劑進行聚合反應，反應完成后將模板分子洗脫出來，形成的一種具有固定空穴大小、形狀及有確定排列功能團的交聯高聚物（圖7）[58]。分子印跡聚合物是通過體外化學合成的，具有結構可預測性、高度的專一性、較好的穩定性及可重復性[59-60]。分子印跡聚合物已廣泛應用于固相萃取技術、色譜技術及傳感器檢測技術。在檢測技術方面，可用于多種領域靶標分子的檢測[61-63]，如醫藥、臨床診斷、食品安全與環境監測領域。關于分子印跡聚合物在SPR檢測方法中作為識別分子對農藥檢測的研究已經逐步發展，由于分子印跡聚合物的高度專一性及SPR技術的快速反應性、高度敏感性及無需標記性，得到不錯的研究成果，如表3所示。2016年Shrivastav等[64]報道了一種基于光纖維及生物分子印跡聚合物的SPR生物傳感器，并成功應用于丙溴磷的檢測，其檢測限（limit of detection，LOD）可達到2.5×10-6μg/L，檢測范圍為10-4～10-1μg/L，其原理是：首先將銀鍍在多模光纖上，然后在銀膜表層涂上針對丙溴磷的分子印跡聚合物，當丙溴磷引入時，可與分子印跡聚合物結合，并改變其折射率，SPR可以快速準確地捕捉到這種變化，隨著靶標濃度的不同，其折射率變化不同，從而達到不同濃度靶標物質的檢測（圖8）。利用相同原理，Atar[65]及Shaikh[66]等分別選用不同的單體及交聯劑對檸檬酸及雙酚A進行了檢測。用分子印跡聚合物作為識別元件還可以實現多個靶標同時檢測，如2017年Saylan等[67]首先將N-甲基丙烯酰基-1-苯丙氨酸甲酯單體與氰嗪、西馬嗪、及莠去津進行化學反應，然后再加入單體（1-乙烯基咪唑）、交聯劑（乙二醇二甲基醚）進行2 h預聚合，最后加入N,N’-偶氮二異丁腈引發劑在SPR芯片上進行印跡聚合物的合成，此聚合物可以同時識別這3 種農藥，并且經檢測得到較低的檢測限，分別為0.095、0.031、0.091 nmol/L。為了增強信號，Shrivastav等[68]將10～30 nm的銀納米顆粒引入印跡膜中，其靈敏度比未添加銀納米顆粒的傳感器提高了2 倍。不同的是Verma等[69]首先在光纖維的表面涂抹一層銀金屬膜，然后在其表層制備四環素的分子印跡膜，從而得到高選擇性的光纖傳感器。Kara等[70]用微乳液兩相聚合方法制得氯霉素分子印跡膜，通過SPR對其檢測，檢測限低至40 ng/kg。

圖7 分子印跡聚合物制備過程簡易原理圖[58]Fig.7 Schematic diagram of MIP preparation process[58]

圖8 基于MIP的SPR裝置示意圖[64]Fig.8 Schematic diagram of SPR device based on MIP[64]

表3 基于分子印跡聚合物識別元件的SPR傳感器在食品檢測中的應用Table3 Application of SPR sensors based on MIP recognition elements in agricultural product detection

1.4 蛋白質

凝集素是動植物蛋白質或糖蛋白，其可以選擇性地結合細菌細胞表面主要結構成分的多糖結構，Wang Yixian等[77]用凝集素作為SPR的識別元件對大腸桿菌的進行了檢測，通過自組裝單層將凝集素固定在SPR芯片上，在緩沖溶液中捕獲大腸桿菌O157:H7，原理如圖9所示，并從5 種不同植物中篩選對大腸桿菌選擇性較高的凝集素，成功用于黃瓜和碎牛肉樣品中細菌的檢測。與上述不同的是，Olguín等[78]利用Toll樣受體5可以特異性識別鞭毛蛋白（細菌鞭毛的結構蛋白）的特性來檢測大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏菌，這項研究證明了蛋白脂質體作為識別元件用于快速檢測鞭毛細菌的實際可能性，這可以幫助人類避免食用被污染的食物，從而防止腸道感染。用蛋白質作為識別元件還可以來檢測重金屬，如Raz等[79]用金屬硫蛋白來檢測銀離子，取得不錯的結果。

圖9 用于大腸桿菌O157:H7檢測的凝集素-SPR傳感器原理圖[77]Fig.9 Lectin-SPR sensors for the detection of Escherichia coli O157:H7[77]

圖10 用于檢測SEB的基于肽的SPR傳感器示意圖[81]Fig.10 A peptide-based SPR sensor for the detection of SEB[81]

1.5 肽

肽作為大分子的一類也可以用來作為SPR的識別元件，如Ding Xiaokang等[80]在2012年通過噬菌體展示技術文庫篩選出兩段寡肽片段，分別與噻蟲啉及吡蟲啉具有親和性，于是將寡肽作為識別分子應用到SPR技術中，對噻蟲啉及吡蟲啉進行檢測，檢測限可分別達到1.2 μmol/L和0.9 μmol/L，雖然檢測靈敏度較低，但是為農藥檢測的分子識別選擇提供了新的思路。2014年，Dudak等[81]用從噬菌體展示文庫中得到的24-mer肽來識別檢測葡萄球菌腸毒素B，并成功在牛奶樣品中進行了測試，進一步證明了肽作為SPR識別元件的可能性（圖10）。

1.6 酶

有機磷與氨基甲酸酯類農藥是乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）的抑制劑，此兩類農藥可以與AChE上的活性位點絲氨酸殘基形成共價鍵結合，從而抑制AChE的活性，因此可以將AChE作為SPR傳感器上的識別分子進行農藥的檢測，近年來在這方面的研究并不多（表4），可能是由于其較低的專一性所致。Kumar等[82]利用此原理同時檢測了馬拉硫磷及敵百蟲，此研究的特殊之處是引入了納米銀離子并且將其固定在玻璃板上，解決了膠體銀影響納米粒子在水相中聚集及污染水源的問題，而且有效提高了傳感器的檢測靈敏度，達到0.455 nmol/L和5.46 nmol/L。Lin等[83]在檢測對氧磷時也引入了金屬納米粒子來提高靈敏度，達到0.234 ng/mL。

表4 基于乙酰膽堿酯酶識別元件的SPR傳感器在食品檢測中的應用Table4 Applications of SPR Sensors based on acetyl cholinesterase recognition elements in agricultural product detection

2 結 語

SPR傳感器應用于食品安全檢測已取得了較好的進展，為了增加其應用，還應做到以下幾點：1）增加與納米技術的聯用，提高對小分子物質的檢測靈敏度；2）發展有效的可再生SPR芯片，降低實驗成本；3）開發多通道、多組分識別SPR傳感器，如與微流控技術相結合，實現高通量復合檢測；4）降低儀器成本，使儀器便攜化、小型化。