?牛糞堆肥纖維素高效降解菌的篩選和應用?

摘 要：為解決牛糞堆肥過程中纖維素難以降解的難題，通過采用羧甲基纖維素篩選平板和剛果紅染色的方法，篩選得到了1株高效降解纖維素的細菌X7，其纖維素酶活達40.02±2.87 U/mL，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。將降解菌X7配合堆肥接種劑應用于牛糞堆肥中，檢測其降解和堆肥促進效果，結果表明：降解菌能提升堆肥溫度，使堆肥最高溫度達74℃，堆肥高溫期持續16 d;添加降解菌X7后堆肥結束時的腐殖質總量達69.3 g/kg，有效提升了堆肥品質，纖維素降解率為43.51%，對照組的降解率僅為11.57%。纖維素高效降解菌X7在牛糞堆肥及纖維素降解應用方面有較大潛力。

關鍵詞：纖維素降解;細菌;牛糞堆肥;腐殖質;堆肥品質

中圖分類號：S182;X172 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）02-0050-04

The Screening and Application of Efficiently Cellulose Degradation Bacteria in Cow Dung Compost

HUANG Ying-jie1， 2，ZHOU Shang-feng1，LIU Zhen-yi1，YUE Yong-zhi1，LI Zu-ren1，

WU La-mei1，WANG Li-feng1， 2

（1. Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. The High School Attached to Hunan Normal

University， Changsha 410006， PRC）

Abstract：In order to solve the problem about cellulose degradation in the process of cow dung compost， the bacteria X7 which can efficiently degrade cellulose had been screened by the method of carboxymethyl cellulose filter plate and Congo red stain. The bacteriaX7 has a cellulose enzyme activity of 40.02±2.87 U/mL， which was identified as Bacillus amyloliquefaciens. Degradation bacteria X7 and compost inoculum were applied in cow dung compost to detect their degradation and compost promotion effect. The result showed that the compost temperature raised up by degradation bacteria X7， the inoculating of X7 made the highest temperature of cow dung compost to 74 ℃，

with the compost temperature period for 16 days. At the end of compost， the humus extract totaled 69.3 g/kg after adding degradation bacteria X7 which can effectively improve the quality of the compost with the cellulose degradation rate 43.51%， while the degradation rate was only 11.57% in the control group. In conclusion， the bacteria X7 which can efficiently degrade cellulose have great potential applications in cow dung compost and cellulose degradation applications.

Key words：cellulose degradation; bacteria; cow dung compost; humus extract; composting "quality

隨著我國人口的增多和養殖業產業結構的調整，養殖業呈現集約化迅猛發展的趨勢[1]，在產生巨大的經濟和社會效益的同時，也帶來了畜禽糞便廢棄物集中大量產生、難以快速處理的問題。其中，大牧場化條件下的牛養殖所產生的牛糞對草場具有較強的破壞作用，牛糞若不及時清理和處理，非常容易使草場退化或引起疫病，從而造成巨大的經濟損失[2]。

高溫好氧堆肥是解決畜禽糞便較為經濟有效的處理方法之一[3]，不僅能解決環境污染問題，還能夠將廢棄物堆制成肥料或土壤調節劑從而產生一定的經濟效益。畜禽糞便經過堆肥所制成的有機肥肥力強，對土壤改良作用[4]。在人工條件下通過添加外源菌劑可提高堆肥堆體中微生物數量，達到加速堆肥反應進程，縮短堆肥周期的效果，可使牛糞等畜禽糞便得到快速處理[5]。牛糞中含有大量未能消化的纖維素，且纖維素在堆肥過程中難以降解，有研究結果表明，木質纖維素的降解是限制牛糞等畜禽糞便堆肥腐熟進程，并影響其堆肥產品品質的關鍵因素[6]。因此，篩選纖維素高效降解菌添加入糞便堆肥中是提升堆肥技術、解決糞便帶來的污染問題的有效途徑[7-8]。通過羧甲基纖維素鈉平板和酶活測定的方法篩選出具有高效降解纖維素能力的芽孢桿菌，并將降解菌接種于牛糞堆肥中，為牛糞堆肥接種菌劑的開發和堆肥效率的提高提供理論依據和實踐指導[9-10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛糞（湖南農業大學動物科學技術學院提供），水稻秸稈（湖南省農業生物技術研究所提供），堆肥接種劑（湖南省農業生物技術研究所提供）。

1.2 試驗試劑

1.2.1 DNS（3，5-二硝基水楊酸）試劑 將6.3 g 3，5-二硝基水楊酸和262 mL濃度為2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用。

1.2.2 磷酸緩沖液 稱取磷酸二氫鈉31.2 g，定容至1 000 mL，配置濃度為0.2 mol/L的A液;稱取磷酸氫二鈉71.63 g，定容至1 000 mL，配置0.2 mol/L的B液。

取A液43.5 mL和B液56.5 mL，混合均勻，pH計測定校正pH 值6.7±0.02。

1.2.3 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液 稱取CMC-Na

固體6.670 g，緩慢加入0.2 mol/L pH值6.7的磷酸緩沖液600 mL，邊加熱邊磁力攪拌直至全部溶解，冷卻后補加蒸餾水600 mL，調節pH值至6.7，再以pH 值6.7磷酸緩沖液定容至1 000 mL，保存于4℃備用。

1.2.4 葡萄糖標準溶液 準確稱取1.000 g分析純葡萄糖 （預先在105℃烘干至恒重），然后加水定容至1 L，即得1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

1.3 培養基配方

1.3.1 LB培養基 蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH值7.0～7.2 g/L;固體培養基加瓊脂粉18 g/L。

1.3.2 纖維素篩選培養基 微晶纖維素鈉10.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH值7.2。

1.3.3 麩皮發酵產酶培養基 麩皮3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，

用0.5 mol/L的NaOH調節pH值至6.7。

1.4 試驗方法

1.4.1 纖維素高效降解菌篩選 從牛糞堆肥取樣10 g，放入裝有100 mL無菌水的三角瓶中，在搖床上180 r/min 振蕩30 min，梯度稀釋，取稀釋液涂布在LB培養基中，于37℃恒溫培養24 h，挑取長勢較快的細菌純化至新的LB平板中保藏。

將保藏的菌株用牛津杯法接種于纖維素篩選平板培養基中，置于37℃培養2～3 d，通過1 mg/mL剛果紅溶液染色30 min，1 mol/L NaCL溶液清洗30 min，測定相應水解圈直徑（D）。選擇水解圈大的菌株測定纖維素酶活。

纖維素酶活測定：酶活定義：1 mL粗酶液在pH值6.7，37℃條件下，1 min水解CMC-Na產生1 μg葡萄糖為一個酶活力單位，以U/mL表示。操作方法參見QB2583—2003《纖維素酶制劑》中CMC-Na-DNS法測定纖維素酶活。

選擇纖維素酶活高菌株進行菌種鑒定[11]，最終得到纖維素高效降解菌X7。

16S rDNA基因序列分析：細菌DNA提取按參考文獻[12]進行。以提取菌株的基因組為模板，用細菌16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，參照天根生化科技有限公司的DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行回收，純化后的產物測序由北京奧科生物技術有限責任公司的ABI 3730XL自動測序儀完成。所得序列與GenBank 數據庫中序列進行Blast 比對分析，利用MEGA4.0構建系統進化樹，根據菌株間的親緣關系確定菌株的種屬[13]。

1.4.2 牛糞堆肥試驗設計 試驗共設CK、A、B共3 組。每組均用新鮮牛糞與稻草秸稈按體積比6∶4 進行配比，C/N調節至25～30 之間，水分控制在55%左右，其中CK組為對照，接種0.5%無菌水;A組接種0.5%堆肥接種劑;B組接種0.25%堆肥接種劑和0.25%纖維素降解菌X7。

在堆肥的第1、4、7、11、18、21和25 d進行翻堆，并于翻堆前采集樣品，整個堆肥周期為25 d。每次采樣分別從堆體的上、中和下部多點取樣，并測定溫度、有機質含量、腐殖質含量及纖維素降解率[14]，方法如下：

（1）溫度：將溫度計插入堆料中部，每天早上9：00點讀數，并記錄環境溫度;（2）有機質：馬弗爐灼燒差重法;（3）全氮：濃H2SO4-H2O2消化凱氏定氮法（國標NY 525—2012）;（4） 腐殖質：采用0.1 mol/L焦磷酸鈉和0.1 mol/L氫氧化鈉浸提劑提取腐殖質，腐殖質在強堿性的介質中具有極強的絡合能力，能將土壤中的難溶于水的結合態腐殖質，一次結合成易溶于水的腐殖酸鈉鹽，從而比較完全地將腐殖質浸出到溶液中來。浸出液測定其含碳量（%），作為腐殖質含量[15];（5）纖維素降解率的測定：纖維素降解率的測定參照GB/T744—2004的測定方法[16]。

2 結果與分析

2.1 纖維素高效降解酶篩選

以纖維素為底物的篩選培養基篩選纖維素降解菌，篩選部分結果如表1所示（只選擇降解圈較大的菌株進行酶活測定）。

結果表明：7株菌株有較高的纖維素降解能力，在羧甲基纖維素鈉篩選平板上的降解圈均達3 cm以上，其中菌株X7的降解能力最強，降解圈達6.09±0.26 cm，纖維素酶活達40.02±2.87 U/mL。故選擇菌株X7為最終篩選菌株，并對其進行進一步的分離純化、保存和鑒定。

2.2 纖維素高效降解酶鑒定

將菌株X7的16S rDNA基因序列與Genebank的核酸序列進行同源性比對（Blastn）結果如圖1所示，菌株X7同 Bacillus amyloliquefaciens（AB255669）的相似度達到99%。使用軟件mega4.0以Neighbor-Joining法構建系統發育樹，并結合各菌株菌落形態和生理生化特征，菌株X7分別被鑒定為解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）。

2.3 牛糞堆肥溫度變化

在堆肥開始前，對堆肥原料：牛糞及水稻秸稈進行含水率、有機碳、全氮、pH值進行測定，計算C/N，結果如表2所示。堆肥堆體C/N 應調節至25～30 之間，水分控制在55%至65%左右[17]，計算得出新鮮牛糞與稻草秸稈應按體積比6∶4 進行配比。

根據溫度的變化，堆肥可分為升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期4個不同階段，高溫環境可使堆體中腐熟菌快速繁殖，使堆體有機質降解速度加快，因此堆溫的變化決定了堆肥腐熟化進程，是高溫堆肥腐熟的重要參數之一[18]。

牛糞堆肥溫度變化如圖2所示。在升溫階段，B組升溫最快，經1 d時間溫度便以達到50℃以上，比A組和CK分別提前1 d和2 d;A和B堆體最高溫度分別達到71℃和74℃，而CK組堆體最高溫度僅為51℃，且A和B組高溫期持續時間為14 d和16 d;而CK組溫度在堆肥周期內保持較低水平，其腐熟程度不完全;進入降溫期，各試驗組溫度下降明顯。堆肥接種劑對牛糞堆肥前期溫度有較強提升作用，能加快牛糞有機質的降解，從而提升堆體溫度。在接種堆肥接種劑的基礎上接種纖維素降解菌可使牛糞中的纖維素快速降解，進一步提升堆體溫度和有機質降解速率。

2.4 腐殖質含量

對堆肥樣品腐殖質（humic extract，HE）總量進行測定，結果如圖3所示。在堆肥結束時，A處理的腐殖質總量為53.81 g/kg，B處理的腐殖質總量為69.3 g/kg，CK處理的腐殖質總量為30.64 g/kg，表明試驗所選用的堆肥接種劑有利于腐殖質在牛糞堆肥降溫腐熟期的轉化聚合，所篩選的纖維素降解菌可有效降解牛糞堆肥堆體中的纖維素，有利于腐殖質的累積和轉化。由于堆肥不完全，CK組腐殖質含量最低，腐熟不完全;在纖維素降解菌和堆肥接種劑的共同作用下，B組處理的有機質降解程度最高，難以降解的纖維素被分解轉化為腐殖質，因此其腐殖質總量最高，腐熟程度高使其堆肥物化產品肥效更好、價值更高[19]。

2.5 纖維素降解率的變化

對不同時間不同處理牛糞堆肥樣品纖維素含量變化進行測定，纖維素降解率結果如圖4所示。由圖可知，盡管對照組CK沒有添加降解菌和堆肥接種劑，其堆體纖維素降解率仍有11.57%，這是由于堆肥堆體中含量土著微生物，對牛糞和水稻秸稈中的纖維素有一定降解效果;添加纖維素降解菌X7和堆肥接種劑使牛糞堆肥堆體纖維素降解率大幅提升，其中A處理添加堆肥接種劑使堆體纖維素降解率達24.29%，B處理添加堆肥接種劑和纖維素降解菌降解了堆肥堆體43.51%的纖維素。此外，纖維素降解在堆肥后期速度加快，這是由于纖維素降解酶在較低溫度下酶活高，在堆肥高溫期不能快速降解纖維素所致[20]。

3 結 論

研究采用羧甲基纖維素鈉篩選平板和剛果紅染色法從自然發酵的牛糞中獲得1株高效纖維素降解菌X7，經鑒定菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。降解菌X7為增殖快、降解能力強的芽孢桿菌，其纖維素降解圈達6.09±0.26 cm，粗酶液纖維素酶活達40.02±2.87 U/mL，能快速降解纖維素，適用于牛糞等纖維素含量高的物料堆肥。接種纖維素降解菌X7后，牛糞堆肥堆體溫度與對照組相比大幅提高，最高溫度達到74℃，高溫期持續時間為16 d，而CK組堆體最高溫度僅為51℃;纖維素降解菌的添加使堆肥結束時的腐殖質總量達69.3 g/kg，而CK處理的腐殖質總量為30.64 g/kg，提升對牛糞堆肥品質;纖維素降解率的測定表明。添加降解菌X7的確是牛糞堆肥中的纖維素得到降解，其降解率為43.51%，對照組的降解率僅為11.57%。

研究篩選得到纖維素高效降解菌X7，并在牛糞堆肥中進行了應用，結果表明：降解菌在配合堆肥接種劑使用下，能有效提高堆肥溫度，加快堆肥進程;在大幅提升纖維素降解的同時，提高了堆肥中腐殖質的含量，從而提高堆肥品質。

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