5種高產洛伐他汀曲霉的篩選和鑒定

摘要：從不同生境（食品、土壤、空氣、有機質等）收集的自然發酵樣品中分離純化獲得150株曲霉純菌株；經薄層層析法（TLC）初篩獲得25株產洛伐他汀（Lovastatin）的曲霉菌株；進一步用高效液相色譜法（HPLC）復篩獲得5株Lovastatin產量較高的曲霉菌株，產量范圍為32～56mg/L。對篩選的5株曲霉菌株進行形態特征描述和鑒定，依據曲霉菌株菌落特征、顯微特征，結合18S rDNA或ITS rDNA基因序列，鑒定這5株菌株分別為棒曲霉（Aspergillus clavatus）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、菌核曲霉（Aspevgillussclerotiorum）、黑曲霉（Aspergillusniger）和米曲霉（Aspevgillus Dryzae）。

關鍵詞：曲霉；洛伐他?。恍螒B特征；篩選；鑒定

中圖分類號：Q939.93 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）03-0001-06

曲霉（Aspergillus）是真菌中的一大類，廣泛分布在谷物、空氣、土壤和各種有機物品上。由于能分解蛋白質等復雜有機物，曲霉一直是發酵工業和食品加工業的重要菌種，目前已被利用的有近60種。早在2000 a以前，我國人民就懂得依靠曲霉來制醬、釀酒。我國特有的調制品豆豉，就是曲霉分解黃豆后加工制成的?，F代工業則利用曲霉生產各種酶制劑、有機酸和糖化飼料。1980年，Alberts等從土曲霉（A.terreus）中提取出洛伐他?。↙ovastatin）的化合物，被認為是降血脂藥物研究領域的一個里程碑。選育高產穩定的產Lovastatin曲霉菌株有著較好的應用前景和重要的現實意義，對篩選的菌株進行特征描述和分類鑒定，可為工業應用提供理論基礎。

曲霉菌絲有隔膜，為多細胞霉菌；在幼小而活力旺盛時，菌絲體產生大量的分生孢子梗；分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈球形；頂囊表面長滿一層或兩層輻射狀小梗（初生小梗與次生小梗）；最上層小梗為瓶狀，頂端著生成串的分生孢子；以上幾部分結構合稱為“孢子穗”；孢子呈綠、黃、橙、褐、黑等顏色。分生孢子梗生于足細胞上，并通過足細胞與營養菌絲相連。曲霉孢子穗的形態，包括分生孢子梗的長度、頂囊的形狀、小梗著生是單輪還是雙輪，分生孢子的形狀、大小、表面結構及顏色等，這些都是菌種鑒定的依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1曲霉屬菌株 從不同生境（食品、土壤、空氣、有機質等）收集自然發酵樣品，經分離篩選得到曲霉屬純菌株。

1.2.1曲霉屬菌株的收集、分離、純化和保存 從食品、土壤、空氣、有機質等發酵樣品表面挑取少量菌絲接人PDA平板表面，28℃培養2～3 d，顯微鏡觀察后挑選具有曲霉屬典型特征的菌落進行純化，獲得性狀均一的曲霉屬純菌株，編號后保存于25%的甘油中，放置-40℃冰箱中備用。

1.2.2高產Lovastatin曲霉屬菌株的篩選 （1）曲霉屬各菌株的培養。保存的菌株在PDA培養基上28℃活化培養3d后，取2菌餅（直徑8mm）接種于種子培養基中，28℃、180 r/min搖床發酵培養2 d，制得種子液；按10%轉接到發酵培養基中，28℃、180 r/min培養7 d，發酵液用于檢測Lovastatin的產量，進行高產Lovastatin曲霉菌株的篩選。（2）薄層層析法（TLC）初篩。發酵液超聲破壁30min，取1.5 mL于離心管中，8000 r/min離心10min，離心之后取上清液500μL，加100μL乙酸乙酯振蕩，萃取上層液為待測樣品，毛細吸管吸取1/4管樣品點5次于硅膠板上；以Lovastatin標準品作對照，乙酸乙酯作展開劑，展開至15 cm，晾干，紫外燈254mm觀察斑點并拍照。（3）HPLC法測定發酵液中Lovastatin含量復篩。取發酵液0.4mL于潔凈的2mL離心管，加入1.6mL的純甲醇，25Hz超聲波30min，50℃水浴2h，間歇振蕩3～4次，8000 r/min離心10min，吸取上清液用0.45 nm的有機膜過濾到另一潔凈的2 mL離心管中，采用HPLC法檢測濾液。HPLC檢測的色譜條件：Agilent 5 TC-C₁₈二代液相色譜柱250×4.6mm；乙腈為色譜純（德國Fisher Scientific公司），磷酸為優級純，水為超純水，檢測波長λ=237 nml，柱溫28℃，流速1 mL/min，進樣量20μL。Lovastatin標準曲線的繪制。①1000μg/mL Lovastatin標準溶液配制：精準稱取Lovastatin標準品0.005 0 g置于50 mL容量瓶，加無水乙醇40 mL，振蕩溶解，定容至50 mL，制成濃度為1 000～g/mL標準品。②取6個1.5 mL離心管，分別用移液槍吸取1、5、10、25、50、100μL的Lovastatin標準液于離心管中，再加入無水乙醇定容到1.0mL。③用HPLC測定，每管Lovastatin標準液重復測定3次，以Lovastatin濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制Lovastatin標準曲線（如圖1）。

1.2.3曲霉菌株的形態觀察 曲霉各菌株接種于PDA平板上28℃培養3-15 d，觀察記錄菌落特征；顯微鏡觀察各菌株的分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等的形態特征，并拍照。

1.2.4曲霉菌株的18S rDNA或ITS rDNA基因序列提取曲霉各菌株的基因組DNA，擴增18S rDNA或ITS rDNA基因，送上海生物工程公司測序。

1.2.5曲霉菌株的鑒定 根據形態特征、18S rDNA或ITSrDNA基因序列，參考曲霉屬《The Genus Aspergillus》分種檢索表，確定目的曲霉菌株的分類地位。

2結果與分析

2.1不同生境收集和純化的曲霉屬菌株

從不同生境收集的自然發酵樣品中共分離純化得到150株曲霉純菌株。不同曲霉菌株的菌落如圖2所示，其分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等形態特征各不相同，表明來自不同生境分離獲得的曲霉屬菌株有較豐富的多樣性。

2.2產Lovastatin曲霉菌株的TLC初篩結果

通過薄層層析法初步篩選獲得25株產Lovastatin的曲霉菌株。如圖3所示，部分曲霉菌株發酵液層析后能明顯觀察到與標準品層析相似的顯色條帶，表明該菌株產Lovastatin較高（如圖3的2，7，8，9，11，12）；部分菌株在該位置條帶不明顯，表明該菌株產Lovastatin能力較弱（如圖3的1，3，4，5，10）。挑取薄層層析目的條帶較明顯的菌株進行HPLC法復篩。

2.3曲霉屬菌株Lovastatin產量HPLC檢測復篩結果

用HPLC法對25株產Lovastatin的曲霉純菌株發酵液進行復篩，如圖4所示，25株曲霉菌株的Lovastatin產量存在顯著差異，Lovastatin產量范圍為5-56μg/mL（數據未顯示）。經篩選編號為A-28、A-59、A-65、A-117和A-138的5株曲霉菌株Lovastatin產量較高，范圍為32.34～56.05μg/mL（表1）。

2.4 5株曲霉菌株形態特征

2.4.1菌落特征（1）A-28菌株：PDA培養基上的菌落初期為白色絨毛狀，2 d后中心菌絲開始變綠，氣生菌絲密而短小，培養5 d后色澤變為灰藍色，邊緣呈白色，培養15 d菌落直徑達50～65mm（圖5），質地粉粒狀，有環形溝紋，分生孢子結構大量，分生孢子區邊緣部分呈現灰藍色；菌落反面灰藍色。（2）A-59菌株：PDA培養基上的菌落初期為白色絨毛狀，質地絲絨狀，培養5 d后色澤變為淡褐色；培養15 d菌落直徑達55～60mm，表面平坦，分生孢子結構大量，淡褐至褐黑色；菌落反面淡黃褐色至黃褐色。（3）A-65菌株：PDA培養基上的菌落初期為白色絨毛狀，培養5 d后色澤變為淺黃色，質地絲絨狀；培養15 d菌落直徑為40～50mm；分生孢子結構稀少；培養15 d后絮狀菌絲中出現大量白色菌絲團塊，而后形成顆粒狀菌核；菌落反面淡黃色。（4）A-117菌株：PDA培養基上的菌落初期為白色絨毛狀，后變成黑褐色粉粒狀，培養15 d菌落直徑達60 mm，有環形溝紋，分生孢子結構大量，黑褐色；菌落反面黃褐色。（5）A-138菌株：PDA培養基上的菌落生長較快，質地疏松，初期為白色絨毛狀，后變為黃褐色；培養15 d菌落直徑達65mm，分生孢子結構大量，黃色；菌落反面淡黃色。

2.4.2分生孢子頭特征（1）A-28菌株：分生孢子頭豐富，幼時棒形（圖6），長度可達300μm，直徑達200μm；分生孢子梗發生于基質，梗莖長短不一，短者500～600μm，長者可達1000μm，直徑30～50μm，壁較薄，光滑無色；頂囊由孢梗莖頂端逐漸膨大成為棍棒形（圖7），長度可達250μm，直徑50～60μm；產孢結構單層，瓶梗密集著生于頂囊的全部表面，一般為8～12μm×2～3μm，生于頂囊基部者較為短小。（2）A-59菌株：分生孢子頭豐富，幼時球形，直徑150～200μm；分生孢子梗發生于基質，孢梗莖1000～2000μm×12～20μm，老時黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近球形，直徑30～40μm，全部表面可育；產孢結構雙層，瓶梗8～10μm×2.5-3.0μm。（3）A-65菌株：分生孢子頭較少，球形至輻射形；分生孢子梗生自基質，孢梗莖200～700μm×6～11μm，壁厚可達1.2μm，近于光滑或顯著粗糙，呈黃褐色；頂囊球形或近球形25～35μm，全部表面可育；產孢結構雙層，瓶梗8～11μm×2～2.5μm。（4）A-117菌株：分生孢子頭豐富，黑褐色球狀，直徑150～350μm；分生孢子梗莖長短不一，壁較薄，表面光滑呈黃褐色；頂囊膨大成球形，雙層小梗。（5）A-138菌株：分生孢子頭放射狀，直徑100～150μm；分生孢子梗長短不一；頂囊燒瓶形，直徑50～60 gm，表面近于光滑；小梗一般為單層，瓶梗15～25μm×5.0～6.5μm，偶爾有雙層，也有單、雙層小梗同時存在于一個頂囊上。

2.4.3分生孢子特征（1）A-28菌株：分生孢子呈暗藍綠色，橢圓形，表面光滑，直徑3～4.5μm×2.5～3.0μm（圖8）。（2）A-59菌株：分生孢子呈褐色，球形或近球形，表面稍粗糙，直徑4～5μm×4.0～4.5μm。（3）A-65菌株：分生孢子球形或近球形，較小，表面光滑，2.5～3.0μm。（4）A-117菌株：分生孢子呈褐色，球形或近球形，表面粗糙，直徑4～5μm×4.0～4.5μm。（5）A-138菌株：分生孢子球形或近球形，較大，直徑8.0～9.0μm×6.5～7.5μm，表面近于光滑。

2.5 5株曲霉菌株的18S rDNA或ITS rDNA基因序列

2.5.1 A-28菌株 18S rDNA基因序列分析結果見圖9，其長度為1 329 bp，與棒曲霉（Aspergillus clavatus）的相似度最高，達99%。

2.5.2 A-59菌株 ITS rDNA基因序列分析結果見圖10，其長度為593 bp，與塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）的相似度最高，達99%。

2.5.3 A-65菌株 ITS rDNA基因序列分析結果見圖11，其長度為580 bp，與菌核曲霉（Aspergillus sclerotiorum）的相似度最高，達99%。

2.5.4 A-117菌株 18S rDNA基因序列分析結果見圖12，其長度為1302 bp，與黑曲霉（Aspergillus niger）的相似度最高，達99%。

2.5.5 A-138菌株 ITS rDNA基因序列分析結果見圖13，其長度為568 bp，與米曲霉（Aspergillus oryzae）相似度最高，為99%。

2.6 5株代表性曲霉菌株的鑒定結果

根據菌株的形態特征，結合曲霉屬（Aspergillus）分種檢索表，鑒定結果如下：A-28菌株為棒曲霉（Aspergillus clavatus）、A-59菌株為塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、A-65菌株為菌核曲霉（Aspergillus sclerotiorum）、A-117菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）、A-138菌株為米曲霉（Aspergillus oryzae）。

3結論與討論

從各地不同生境收集的自然發酵樣品（食品、土壤、空氣、有機質等）中分離純化獲得了150株曲霉屬純菌株。不同曲霉屬菌株的菌落、分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等形態特征各不相同；用HPLC法對25株曲霉屬純菌株發酵液進行Lovastatin產量檢測，結果表明不同曲霉屬菌株Lovastatin產量存在顯著差異，Lovastatin產量范圍為5～56μg/mL。經篩選其中5株曲霉菌株的Lovastatin產量較高，范圍為32～56μg/mL，分別為棒曲霉（Aspergillus clavatus）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、菌核曲霉（Aspergillus scleroliorum）、黑曲霉（Aspergillus niger）和米曲霉（Aspergillus oryzae）。這表明來自不同生境分離獲得的曲霉屬菌株具有較豐富的多樣性，試驗篩選出的Lovastatin高產菌株豐富了Lovastatin工業化生產的菌種資源。