重組人粒細胞集落刺激因子對肝硬化大鼠外周血 干細胞動員的研究

摘要：目的：觀察重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）對四氯化碳（CCL4）肝硬化大鼠外周血中CD34+細胞的動員作用，以及對肝硬化大鼠肝臟生化學的影響，尋求一種安全有效、不加重肝損傷的動員CD34+細胞的方法。方法：50%CCL4橄欖油溶液建立肝硬化大鼠模型，rhG-CSF動員組大鼠皮下注射rhG-CSF10gkg-1d-1，共計5d，對照組給予相同劑量生理鹽水。流式細胞儀測定外周血單個核細胞中的CD34+細胞的比例，同時檢測ALT、AST、T-BIL和ALB，觀察G-CSF對肝硬化大鼠肝臟的影響。結果：肝硬化大鼠rhG-CSF動員后外周血CD34+細胞占單個核細胞（CD34+/MNC）比例（4.081.38）%是生理鹽水對照組（0.430.21）%的9.5倍；而生化學檢測兩組沒有顯著性差異。結論：G-CSF動員能促進更多的骨髓/造血干細胞源性的肝干細胞在外周血中表達，而且不加重肝硬化大鼠的肝臟損傷。

關鍵詞：粒細胞集落刺激因子（G-CSF）；干細胞；CD34細胞動員

肝炎病毒、酒精、藥物、化學物質以及遺傳代謝等等諸多原因皆可以損傷肝臟功能，最終表現為肝硬化、肝功能衰竭等終末期肝臟病變，嚴重危害人們的身體健康。終末期肝病一般需要肝移植才能徹底解決，但是由于肝臟供體來源受限，人們逐漸嘗試肝干細胞替代治療的方法來讓病人度過手術等待期，或用這種方法進行肝臟病人的治療。

目前認為肝臟干細胞主要有肝源性和非肝源性兩個方面的來源。肝源性肝干細胞主要為肝卵圓細胞（hepaticovalcell，HOC）。HOC是從小鼠肝臟中分離出來的，當各種致病因素使肝細胞增殖受限時，HOC可進一步分化為肝細胞及膽管上皮細胞，因而認為是一種肝干細胞。現在已經有證據表明至少有一部分HOC是由骨髓源前體細胞演變而來。Crosby采用骨髓造血干細胞標志c-Kit和CD34觀察肝硬化患者肝組織存在著CD34+細胞，其主要位于膽管周圍的門靜脈區。因此，HOC是一類具有骨髓干細胞的某些表型、克隆原性及雙向分化潛能的細胞。

骨髓/造血干細胞可以由骨髓、臍帶血和外周血三種來源獲得。外周血造血干細胞有著收集方便、來源廣泛、供體不需要麻醉、創傷小以及易于患者接受等優勢，因而受到了越來越多的重視。

本研究是通過粒細胞集落刺激因子（granularcellstimu latingfactor，G-CSF）對四氯化碳（CCL4）致肝硬化大鼠進行動員，檢測肝臟以及外周血中CD34+細胞表達的變化，觀察G-CSF對外周血干細胞的動員作用，同時觀察動員的肝硬化大鼠肝臟的生化學、組織病理學改變，評價G-CSF對肝硬化大鼠機體的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，體重180～220g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。實驗前分籠飼養，自由飲水，室溫22～26，飼養1周后用于實驗。

1.2主要試劑及藥品

重組人粒細胞集落刺激因子、兔抗鼠CD34抗體、FITC-羊抗兔IgG抗體、RPMI1640、胎牛血清和Ficoll分離液分別由日本麒麟株式會社、Santa-Cruz公司、Jackson公司、Gibco公司和Sigma公司生產。

1.3實驗分組

將36只大鼠隨機分為四組，正常組6只，不進行任何處理。余30只進行CCL4造模，造模成功后處死6只作為肝硬化模型組。對造模成功的大鼠隨機分為生理鹽水組和G-CSF動員組各8只。

1.4實驗方法

1.4.1肝硬化模型的制備

經大鼠大腿內側、背部、腹部皮下注射50%的橄欖油CCL4溶液（橄欖油與CCL4的體積比為1?1），劑量3mL/kg，1次/3d，測量大鼠體重，根據體重調整劑量，注射23次后停藥觀察大鼠體重，以不增加為準，若仍體重增加，原量注射直至體重恒定。肝臟組織病理學證實模型成功。

1.4.2肝臟組織病理學檢查。對肝硬化模型建立的組織病理，使用石蠟切片。取造模大鼠肝臟右葉，切成1cm#1cm#0.5cm大小組織塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，5m切片，行HE染色和Masson染色。常規病理制片，顯微鏡下由同一名病理醫生閱片，找尋10步驟的拍攝區域普通顯微鏡拍照。

1.4.3G-CSF動員

動員組8只大鼠每天早晨9點鐘，皮下注射G-CSF10gkg- 1d-1，連續5d，對照組8只注射同劑量生理鹽水。

1.4.4肝功能生化學檢查

血清采集后-20！保存，一次上機檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（T-BIL）和白蛋白（ALB），由同一全自動生化分析儀完成。

1.4.5動員后外周血CD34+細胞表達的評價

MNC的提取%流式細胞儀檢測MNC中CD34+細胞

1.4.6統計學分析。使用SPSS10.0軟件對正常大鼠、肝硬化大鼠、G-CSF動員后大鼠的ALT、AST、TBIL、ALB以及流式細胞儀檢測的CD34+細胞占MNC的百分比進行統計分析，計量資料采用xs（均數標準差）表示，方差齊時t檢驗，方差不齊t檢驗。等級資料采用卡方檢驗。

2結果

2.1肝硬化動物模型的建立

30只大鼠使用50%CCL4造模過程中，死亡4只，死亡率13.3%。經HE、Masson染色進行肝臟組織病理學檢查，可見膠原纖維大量增生、包繞變性壞死肝細胞及大小不等的假小葉形成等，組織學證實肝硬化造模成功。50%CCL4皮下注射26次后，大鼠ALT，AST，TBIL都有不同程度的升高（P<0.01），白蛋白下降（P<0.01）。提示造模大鼠有明顯的肝功能損害。

2.2G-CSF動員效果對比

使用流式細胞儀對周血中CD34+細胞進行檢測。結果顯示，動員組肝硬化大鼠外周血中CD34+細胞占MNC比例為（4.081.38）%，是生理鹽水組（0.43+-0.21）%的9.5倍，P<0.01。

2.3使用rhG-CSF動員與生理鹽水對照組生化指標對比

兩組肝功能生化指標（ALT、AST、ALB、TBIL）變化對比，無顯著性差異，P>0.05。

3討論

G-CSF是由Welte等在1985年克隆并純化的，由2個長環和1個短環連接的4條反向平行的螺旋鏈組成。自90年代初獲準臨床應用。目前認為G-CSF動員的機制主要有以下幾個方面：?影響造血干細胞表面黏附分子的表達及功能，特異性誘導粒系祖細胞的增殖、分化和成熟，并抑制外周血造血干細胞的凋亡。下調骨髓微環境內皮細胞粘附分子的表達，促進基質金屬蛋白酶釋放及降解細胞外基質。G-CSF對CD34+細胞的動員作用是呈動態變化的。研究發現，對健康者皮下注射G-CSF，外周血CD34+細胞數量在第6天達到高峰，其數量與G-CSF用量相關。本研究通過流式細胞儀檢測發現，肝硬化大鼠G-CSF連續使用5d后，外周血中CD34+細胞占單個核細胞的比例較使用生理鹽水增加了9.5倍。G-CSF對肝硬化大鼠外周血中的CD34+細胞有很明顯的動員作用，且沒有加重肝臟損傷的影響。目前，對肝硬化個體的動員以獲得CD34+細胞的研究還未見報道。

綜上所述，G-CSF對肝硬化大鼠是一種安全有效的獲取外周血中更多CD34+細胞的方法。動員后的外周血中骨髓/造血干細胞源性的肝干細胞，可以用于多種部位的自體移植或者在體外培養擴增分化為肝細胞的研究，從而為各種終末期肝病的細胞學治療提供一種可能的細胞來源。

參考文獻：

[1]立野知世，吉田勝利.肝膽細胞.蛋白核酸酵素.[J] 2000，45：2085-2091