門冬氨酸鳥氨酸高效液相色譜法條件的篩選

摘要：目的：根據(jù)中國藥典2015年版門冬氨酸鳥氨酸有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的方法，利用HPLC法檢測(cè)門冬氨酸鳥氨酸，各物質(zhì)的分離度不符合中國藥典2015年版要求。本文主要研究色譜條件的改變對(duì)門冬氨酸鳥氨酸各雜質(zhì)分離度的影響，以得到較好的色譜條件進(jìn)行門冬氨酸鳥氨酸的研究。方法：采用HPLC法檢測(cè)門冬氨酸鳥氨酸各物質(zhì)分離度。結(jié)論：0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05）：乙腈=40：60；檢測(cè)波長：205nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl時(shí)，各物質(zhì)的分離效果最佳。

關(guān)鍵詞：中國藥典；HPLC法；門冬氨酸鳥氨酸；分離度

門冬氨酸鳥氨酸是由門冬氨酸和鳥氨酸合成，可用于治療因急、慢性肝病引發(fā)的血氨升高及肝性腦病[1，2]。目前有以下幾種檢測(cè)門冬氨酸鳥氨酸有關(guān)物質(zhì)的方法：柱前衍生HPLC法、柱后衍生化法和HPLC法[3，4]。柱前衍生HPLC法和柱后衍生化法均不太適用于有關(guān)物質(zhì)的檢查，重復(fù)性差，準(zhǔn)確性低。HPLC法屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好。耐用性高，操作方便

1、儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀Agilent1260（德國安捷倫科技有限公司）；高效液相色譜儀1260（安捷倫科技有限公司）；ML204T型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；XSE205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UltimateXB-NH2型色譜柱（Welch）

1.2試藥

門冬氨酸鳥氨酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)：140749-201502；含量：96.6%）；

馬來酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)：190015-201302；含量：99.7%）；富馬酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)：111541-201102；含量：99.4%）；精氨酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)：140685-201506；含量：99.9%）；3-氨基-2-哌啶酮（雜質(zhì)Ⅰ）對(duì)照品（QUALITY CONTROL CHEMICALS INC.；批號(hào)：21-OCT-14-2；含量：100%）；

門冬氨酸縮合物（雜質(zhì)Ⅱ）對(duì)照品（QUALITY CONTROL CHEMICALS INC.；批號(hào)：12-MAY-17-0；含量：98.23%）。

乙腈為色譜級(jí)，磷酸二氫鉀、濃氨溶液、磷酸試劑均為分析純。

2、方法與結(jié)果

2.1《中國藥典》2015年版門冬氨酸鳥氨酸色譜條件

色譜柱：氨基鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：0.02mol/L磷酸二氫鉀（取磷酸二氫鉀2.72g，加水500ml溶解后，加入濃氨溶液5ml，用水稀釋至1000ml，混勻后用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.60±0.05）：乙腈=40：60；檢測(cè)波長：205nm；流速：1.3ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液的制備

取門冬氨酸鳥氨酸原料藥0.4g，精密稱定，置100ml量瓶中，加0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液40ml使溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2對(duì)照溶液的制備

精密量取門冬氨酸鳥氨酸供試品溶液適量，加流動(dòng)相定量稀釋制成每1ml含門冬氨酸鳥氨酸4μg的溶液，作為對(duì)照溶液。

2.2.3雜質(zhì)對(duì)照品溶液的制備

精密稱取馬來酸、富馬酸、精氨酸、3-氨基-2-哌啶酮（雜質(zhì)Ⅰ）與門冬氨酸縮合物（雜質(zhì)Ⅱ）各對(duì)照品適量，分別加流動(dòng)相溶解并定量稀釋成每1ml中約含4μg的溶液，作為各雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性溶液的制備

另取門冬氨酸鳥氨酸、馬來酸、富馬酸、精氨酸、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ各對(duì)照品適量，置同一量瓶中，加流動(dòng)相適量使溶解并稀釋制成每1ml中約含門冬氨酸鳥氨酸4mg，馬來酸、富馬酸、精氨酸、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ各4μg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3色譜條件的篩選

2.3.1流動(dòng)相比例的篩選

以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05）：乙腈=40：60（圖1）、50：50（圖2）、30：70（圖3）、35：65（圖4）為流動(dòng)相，分兩個(gè)泵；檢測(cè)波長：205nm；

流速：1.3ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。（不包含雜質(zhì)Ⅰ雜質(zhì)Ⅱ）各流動(dòng)相色譜圖如下：

由上述四圖可得，以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05）：乙腈=30：70為流動(dòng)相，分兩個(gè)泵時(shí)，各物質(zhì)分離度均符合要求。

以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05）：乙腈=30：70為流動(dòng)相，混合；檢測(cè)波長：205nm；流速：1.3ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl。色譜圖如下：

以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05）：乙腈=30：70為流動(dòng)相，混合時(shí)，系統(tǒng)不符合試驗(yàn)要求。

2.3.2流動(dòng)相pH的篩選

以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05（圖六）、pH4.2±0.1（圖七）、pH4.9±0.1（圖八））：乙腈=40：60為流動(dòng)相；檢測(cè)波長：205nm；流速：1.3ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。（不包含雜質(zhì)Ⅰ雜質(zhì)Ⅱ）各流動(dòng)相色譜圖如下：

由上述圖譜可得，0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH5.60±0.05，各物質(zhì)的分離度均符合要求。

2.3.3流速的篩選

以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05）：乙腈=40：60為流動(dòng)相；檢測(cè)波長：205nm；流速：1.3ml/min、1.0ml/min、0.7ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl（包含雜質(zhì)Ⅰ雜質(zhì)Ⅱ）。

當(dāng)流速為1.0ml/min時(shí)，系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)分離度均符合中國藥典2015版要求。

3、討論

由以上試驗(yàn)得出，當(dāng)色譜條件為：0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH5.60±0.05）：乙腈=40：60；檢測(cè)波長：205nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl時(shí)，各物質(zhì)的分離效果最佳。以此為色譜條件進(jìn)行門冬氨酸鳥氨酸研究。

參考文獻(xiàn)：

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