犬發情期血清孕酮水平與最佳配種時間測定

張斌 歷可 周紅蕾 卓國榮 武彩紅

（江蘇農牧科技職業學院 225300）

犬的發情是指犬在達到性成熟后在一些激素的作用下出現生理和行為的周期性變化。在繁殖學上講，犬是季節性單次發情動物或者雙次發情動物[1]正常情況，母犬一般一年發情兩次，母犬發情的標志是陰道流血，陰道流血正常情況下會持續21d左右[2]。每次發情間隔約6個月左右，單養犬多數在春秋兩季發情 （3～5月，9～11月）。根據犬的不同性生理變化，把犬性周期分為4個階段，即乏情期、發情前期、發情期、發情間期[3]。

法國斗牛犬發情期季節性較明顯，一般春秋兩季各一次，少數法國斗牛犬一年只發情一次，有的發情3次。法國斗牛犬發情期主要表示為陰門水腫，血性分泌物，接受爬跨交配。法國斗牛犬最初發情可出現在7～8月齡，發情期平均9～12d，發情后期配種率較高，即法國斗牛犬出現血性分泌物后第9～12天若交配極有可能懷孕。

通過孕酮的測定與陰道細胞學檢查確定母犬發情與否，以及所處的發情階段并幫助確定最佳配種時間。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取年齡在2～4歲，精神良好，食欲正常，在2017.10～2018.4就診于泰愛牧教學寵物醫院的法斗母犬共16例。就診主要檢測犬發情期變化及孕酮測定。

1.2 實驗儀器及材料

麥克奧迪顯微鏡、孕酮檢測儀。Diff-quik染液一套，購自上海納博科臨動物臨床檢驗實驗室；孕酮檢測試劑盒，購自北京德諾泰克科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 陰道涂片觀察

2.1.1 采樣

實驗犬保定好后，陰道口周圍清潔干凈，將浸泡過生理鹽水的滅菌棉簽插入陰道4～6cm，輕輕轉動棉簽2～3次，以保證棉簽能充分接觸陰道上皮細胞。

2.1.2 染色

將采集好的棉簽陰道內容物均勻涂抹在玻片上，自然晾干，diff-quik染色。首先，將要染色的涂片完全干燥之后放入固定液 （diff-quik A）中10～20s；然后，將涂片從固定液中取出無需沖洗可直接放入diff-quik B染液中染色5～10s，要使diff-quik B染液均勻染色玻片，無需沖洗；最后，將從玻片從diff-quik B液中取出直接放入diff-quik C染液中染色5～10s，要使diff-quik C染液均勻染色玻片。將玻片取出后用生理鹽水沖洗去剩下的染液，自然晾干即可，鏡檢[4]。

2.1.3 鏡檢觀察

每天記錄發情母犬血樣分泌物顏色及分泌量，陰唇腫脹程度等。顯微鏡下觀察陰道涂片，主要觀察角質化上皮細胞的形態、邊緣、核膜，并對角質化上皮細胞比例進行統計。

2.2 血清孕酮測定

實驗犬保定，剃毛，消毒，前肢頭靜脈采血2ml，12000r/min離心3min分離，離心提取血清，用移液器抽取50μl血清加入稀釋液混合均勻后抽取100μl混合液，滴到試劑卡加樣孔上，待混合液從圓孔流到前端空格處，將試劑卡插入熒光儀卡槽內，點擊熒光儀屏幕上的 “開始測試”，10min讀取檢測結果。

3 結果與分析

3.1 陰道涂片細胞形態變化

發情前期 （持續6～11d）：有大量紅細胞和副基底上皮細胞出現，發情期繼續發展會出現紅細胞數量逐漸減少，但上皮細胞會出現角化跡象并且會逐漸增加。到發情前期的晚期時，幾乎所有的上皮細胞都會表現為伴有核固縮的中間細胞，也有時會出現少量的嗜中性粒細胞[8](見圖1)。

發情期 （持續5～9d）：所有的鱗狀上皮細胞為角化狀態，一般呈多邊形，不規則，角化程度不一，著色情況也不一致。通常無核或有一個 “影核”或者固縮的小核殘體；隨著發情的持續，至發情配種后時可達到75%以上，發情期結束后會逐漸下降[7]。無中性粒細胞，可能出現少量的紅細胞；發情末期時紅細胞會持續下降，同時嗜中性粒細胞會急劇上升 （見圖2）。

發情間期 （56～60d）：角化的鱗狀上皮細胞數量急劇下降，中間細胞和副基底細胞再次出現，嗜中性粒細胞數量的增加，有時可見一些紅細胞 （見圖3）。

3.2 血清孕酮的結果

3.2.1 血清孕酮水平

本次試驗對泰愛牧寵物醫院臨床孕酮檢測的16例法斗母犬進行分析，主述所有犬均處于發情期。按照犬場慣例，首次陰道排血記錄為第一天發情。所有犬孕酮測定均在發情第12～14天內檢測[5]。所有犬均采用人工授精方式配種，配種時間均在孕酮測定后48h內完成。一個月后回訪，編號3、5、8、12犬配種不成功，其他犬只都配種成功。成功率75%。配種成功的犬在發情12～14d檢測孕酮值均處25～45ng/ml，配種不成功的犬孕酮均超過45ng/ml。由圖表明孕酮測定值在20～40ng/ml時是最佳配種期 （見附表、見圖 4）。

圖1 發情前期陰道涂片

圖2 發情期陰道涂片

圖3 發情間期陰道涂片

圖4 犬發情期孕酮測定值分布圖

4 討論與分析

4.1 陰道鱗狀上皮細胞角化程度可確定配種時間

資料表明，鱗狀上皮細胞的角化程度和體內雌二醇和孕酮濃度變化息息相關，雌二醇和孕酮水平的變化決定了鱗狀上皮細胞的角化程度[10]。犬在發情開始后的9～12d雌二醇達到峰值，之后逐漸下降，孕酮濃度在發情前期開始后的9～12d也開始升高，在此期間，通過對陰道涂片的連續觀察發現，發情母犬隨著時間推移，角化細胞數量在逐漸增多，發情后第10～ll天可達80%～90%，可維持2～3d，隨后開始逐漸減少消失[6]。因此，可以通過觀察陰道上皮細胞的角化程度來大致確定配種時間。

4.2 孕酮測定確定配種時間

孕酮由黃體分泌，屬于甾體激素，在排卵、妊娠、分娩、乳腺發育等各方面都發揮著至關重要的作用[9]。孕酮在犬發情前期濃度較低，且上升緩慢，一般維持在1～5ng/ml。孕酮達到5ng/ml時犬一般開始排卵。在發情期，隨著雌二醇濃度下降，孕酮濃度會逐漸上升，孕酮濃度達到25～45ng/ml時達到最佳配種時間，孕酮值上升至20ng/ml時可進行第一次配種，48h后可進行第二次配種；孕酮濃度達到25～40ng/ml時建議2～3h后配種，48h后可進行第二次配種，以提高配種成功率。孕酮測定值達到45ng/ml時，說明犬已進入發情后期，不建議配種。

鑒定母犬發情的方法常用陰道涂片和孕酮測定法，每一種方法均有其優缺點[11]。要準確把握犬的配種時間，建議同時使用兩種方法一起判斷。同時，犬的發情會受到年齡、營養狀況、生活環境、光照等多種的條件會影響犬的發情，在生產實踐中，應根據犬實際情況綜合推斷犬最佳配種時間[12]。

附表 犬編號與孕酮結果