青皮藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析Δ

靳貝貝，裴香萍，梁惠珍

（山西中醫藥大學中藥學院，山西 晉中 030619）

青皮，亦稱青桔皮或青柑皮，為蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮[1]。除用橘類的未成熟果實的果皮外，其同屬植物甜橙（C.sinensisOsbeck）、香櫞（C.wilsoniiTanaka）以及茶枝柑（C.chachiensisHort）等柑類未成熟果實的果皮在有的地區亦作青皮使用。青皮為常用中藥，味苦、辛，性微溫，具有破氣行痰、消痞除滿、理氣健脾、燥濕化痰等功效。現代藥理研究表明，青皮具有較好的升高血壓、抗休克等作用[2]，具有抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等活性[3]，還可用于松弛胃腸和子宮平滑肌、促進消化液分泌、利膽、祛痰平喘[4-6]等。揮發油類、黃酮類等是青皮的主要活性成分[7-8]。目前，2015年版《中國藥典》（一部）采用單一成分橙皮苷來控制青皮藥材的質量[1]。本研究通過檢測10批青皮藥材樣品，建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結合聚類分析、主成分分析對其質量進行評價，旨在為青皮藥材的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括四元泵洗脫系統、自動進樣系統、柱溫箱及光電二極管矩陣檢測器（美國Waters公司）；SX-120DT型超聲波清洗機（上海圣訓儀器有限公司）；AB-135型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA/JA1004型萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；HH-2型數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；FW100型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.2 試劑

橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-201617，純度：96.1%）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

共收集青皮藥材樣品10批，經山西中醫藥大學中藥學院裴香萍副教授鑒定為蕓香科植物橘（C.reticulataBlanco）的干燥幼果或未成熟果實的果皮。青皮藥材樣品來源見表1。

表1 青皮藥材樣品來源Tab 1 Origins of C.reticulata

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：XSelect?HSS T3-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%醋酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取橙皮苷對照品5.50 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為0.11 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末約0.2 g，置于50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz）處理30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過；取續濾液2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20170508）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以橙皮苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，11個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.08%，相對峰面積的RSD均小于1.22%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20170508）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以橙皮苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，11個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.50%，相對峰面積的RSD均小于0.79%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 取藥材樣品粉末（批號：20170508）0.2 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以橙皮苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，11個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.50%，相對峰面積的RSD均小于2.97%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評價、共有峰相關分析

圖1 10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of medicinal materials

圖2 藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of medicinal materials

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 分別取10批藥材樣品粉末0.2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，10批藥材樣品的相似度為0.919～1.000，表明各批藥材樣品的化學成分一致性較好，均含有11個成分，但各成分含量存在差異，詳見表3。

表3 10批藥材樣品相似度Tab 3 Similarity of 10 batches of medicinal materials

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 10批藥材樣品有11個共有峰，通過與對照品HPLC圖譜（詳見圖3）比對，指認保留時間為25.588 min的6號峰為橙皮苷峰。其分離度良好，保留時間合適，故以其為參照峰，計算其他峰相對于該峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表4、表5。

圖3 對照品HPLC圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of substance control

2.5 聚類分析

以10批藥材樣品的11個共有峰的相對峰面積為原始數據，采用SPSS 17.0軟件，以系統聚類法結合歐氏距離（d）為測度進行分析，結果見圖4。由圖4可知，d＝20時，10批藥材樣品可聚為2類，S4為一類，其余聚為一類；d＝5時，后一類又可聚為2類，S1、S10聚為一類，S2、S3、S5～S9聚為一類。

2.6 主成分分析

2.6.1 主成分因子特征值、方差貢獻率分析 采用SPSS 17.0軟件進行主成分因子分析，其特征值和方差貢獻率見表6。由表6可知，以特征值＞1為標準，得到前2個主成分因子的特征值分別為8.237、1.935，方差貢獻率分別為75.206%、17.591%，累積方差貢獻率為92.797%＞85%。故采用前2個主成分因子為指標對10批藥材樣品進行評價，詳見表7。由表7可知，主成分因子1可反映成分1、2、3、5、6、8、9、10、11的信息，主成分因子2可反映成分4、6、7的信息。

表4 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 4 Relative retention time of common peaks for 10 batches of medicinal materials

表5 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 5 Relative peak areas of common peaks for 10 batches of medicinal materials

圖4 10批藥材樣品聚類分析樹狀圖Fig 4 Cluster dendrogram for 10 batches of medicinal materials

表6 2個主成分因子的特征值和方差貢獻率Tab 6 Eigenvalue and variance contribution rate of two main component factors

以上述2個主成分因子為變量繪制載荷圖和得分圖，詳見圖5。由圖5可知，載荷圖結果與初始因子載荷矩陣結果相同，距離原點較遠的點為主成分因子1和主成分因子2中權重值較大的成分；由得分圖可知，10批藥材樣品分散在不同區域，表明藥材樣品質量與地域分布有關。

表7 初始因子載荷矩陣Tab 7 Primary factor loading matrix

圖5 10批藥材樣品的載荷圖和得分圖Fig 5 Loading diagram and score chart of 10 batches of medicinal materials

2.6.2 綜合質量評分 以上述2個主成分因子對10批藥材樣品質量進行綜合評分，結果見表8。由表8可知，S7藥材樣品主成分因子綜合得分最高，該批樣品中成分1、2、5、6、9、10、11的含量相對較高，整體質量相對較好綜合得分越高表示藥材樣品整體質量越好[9]）。

表8 10批藥材樣品主成分因子得分及排序Tab 8 Main component factor score and ranking of 10 batches of medicinal materials

3 討論

當前，隨著人們對中藥需求量的增大以及用藥安全意識的加強，中藥質量控制越顯重要。指紋圖譜作為一種有效的中藥質量控制模式，以其科學的理論依據獲得了國際上的一致認可[10]。指紋圖譜在色譜峰未明確為何種成分的情況下，仍能給出充分、可靠的信息，用以控制中藥材質量[11]。

本研究在建立青皮藥材的HPLC指紋圖譜的過程中曾分別考察了乙腈-0.5%醋酸溶液、乙腈-0.2%醋酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.5%醋酸溶液、甲醇-0.2%醋酸溶液、甲醇-水為流動相時色譜峰的分離效果。結果，以乙腈-0.5%醋酸溶液為流動相時分離效果最佳，色譜峰的分離度及峰形均良好，且保留時間合適，故最終選擇乙腈-0.5%醋酸溶液為流動相進行梯度洗脫。本研究還分別考察了在284、300、360 nm不同檢測波長下的出峰情況。結果，檢測波長為360 nm時的出峰數較多，故最終選擇360 nm為檢測波長。

本研究所建立的青皮藥材的HPLC指紋圖譜，可反映藥材樣品的特異性和整體性信息。在11個共有峰中，通過與對照品HPLC圖譜比對指認出了橙皮苷峰。10批藥材樣品的相似度評價結果表明，各批藥材樣品間質量存在差異。各共有峰相對保留時間的RSD差異小，但相對峰面積的RSD相差較大，提示不同產地藥材樣品的成分雖一致，但含量差異較大，這可能與藥材的生長環境、采收季節、加工炮制等因素有關。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結果可為青皮藥材的質量控制提供參考。