淫羊藿總黃酮提取物的HPLC指紋圖譜建立及其中8種成分的含量測定Δ

牛曉靜，魯 靜，孫廣科，段曉穎，徐立然

（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，鄭州 450008）

組分中藥是指由有效組分配伍而成的現(xiàn)代中藥，是創(chuàng)新中藥研究的一種途徑，其特點是“兩個相對清楚”，即物質(zhì)基礎相對清楚及其作用機制相對清楚；組分中藥具有滿足現(xiàn)代藥物質(zhì)量可控要求，安全性、有效性證據(jù)較充分的特征，既保持了中藥方劑的優(yōu)勢，又提高了中藥制劑的質(zhì)控水平[1-4]。本課題組對益元康方按照組分中藥的研究思路開展基礎研究，就該方組成藥材之一淫羊藿中主要有效成分黃酮類成分進行提取、分離、純化，得到淫羊藿總黃酮提取物。本研究中，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了淫羊藿總黃酮提取物的指紋圖譜，并對其中8種成分的含量進行了測定，旨在為有效控制其質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵、二極管陣列檢測器、在線脫氣裝置、自動進樣器、Openl AB色譜工作站（美國安捷倫公司）；CP225D型電子天平、BSA224S-CW型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿總黃酮提取物（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥制劑實驗室自制，編號：G-1、G-2、G-3、G-4、G-5，總黃酮平均含量：71.6%）；淫羊藿苷對照品（批號：110737-200415，供含量測定用）、寶藿苷Ⅰ對照品（批號：111852-201102，供含量測定用）均由中國食品藥品檢定研究院提供；淫羊藿屬苷A對照品（批號：151023，純度：≥98%）、朝藿定A1對照品（批號：16071302，純度：≥98%）、朝藿定A對照品（批號：130520，純度：≥98%）、朝藿定B對照品（批號：130518，純度：≥98%）、朝藿定C對照品（批號：130601，純度：≥98%）、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?51023，純度：≥98%）均由成都普菲德生物技術有限公司提供；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclispse SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫（0～8 min，15%A→20%A；8～25 min，20%A→23%A；25～40 min，23%A→30%A；40→50 min，30%A→32%A；50～68 min，32%A→35%A；68～75 min，35%A→45%A；75～80 min，45%A→60%A；80～85 min，60%A→15%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：270 nm；進樣量：5μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 單一對照品貯備液 精密稱取淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ對照品各適量，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.390、0.282、1.010、1.338、1.792、1.600、0.268、0.908 mg/mL的單一對照品貯備液。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密量取“2.2.1”項下單一對照品貯備液各適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得含淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ質(zhì)量濃度分別為 19.50、28.20、50.50、66.90、89.60、160.00、26.80、27.24 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取樣品20 mg，精密稱定，置于錐形瓶中，加甲醇20 mL振搖使溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：G-1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以淫羊藿苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：G-1）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以淫羊藿苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于4%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取樣品（編號：G-1）適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以淫羊藿苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評價、共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取5批樣品各適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）》對5批樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）》，以樣品的HPLC對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，5批樣品的相似度均大于0.99，表明各批樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見表1。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 5批樣品有22個共有峰，其峰面積合計占色譜峰總面積的90%以上。通過與對照品HPLC圖譜比對，指認了8個共有峰分別為淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ。其中，20號峰為淫羊藿苷峰，由于其分離度較好、響應值較高，故以其為參照峰，計算其他峰相對于淫羊藿苷峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表2、表3。

圖1 5批樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 5 batches of samples

圖2 樣品的HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of sample

表1 5批樣品相似度評價結果Tab 1 Results of similarity evaluation for 5 batches of samples

2.5 含量測定

2.5.1 系統(tǒng)適用性 取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖3。由圖3可知，8種成分峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000。

2.5.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液1、2、5、10、15 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表4。

表2 5批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms from 5 batches of samples

表3 5批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of common peaks in HPLC chromatograms from 5 batches of samples

2.5.3 定量限與檢測限考察 分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結果，淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ的定量限分別為390.00、564.00、506.00、535.20、448.00、426.68、643.20、544.80 ng/mL，檢測限分別為97.50、141.00、126.25、133.80、112.00、106.67、160.80、136.20 ng/mL。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

表4 回歸方程與線性范圍Tab 4 Regression equation and linear range

2.5.4 精密度試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：G-5）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD分別為1.15%、1.15%、0.15%、0.13%、0.08%、0.10%、0.33%、1.46%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：G-5）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ峰面積的RSD分別為1.31%、1.25%、0.15%、0.12%、0.08%、0.09%、0.31%、1.31%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6 重復性試驗 取樣品（編號：G-5）適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ的平均含量分別為2.94%、4.09%、4.76%、7.10%、17.33%、34.49%、0.89%、1.01%，RSD分別為2.04%、2.97%、2.93%、2.31%、2.16%、2.41%、1.61%、0.71%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（編號：G-5）10 mg，共6份，分別加入“2.2.1”項下單一對照品貯備液（淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ對照品貯備液分別加入750μL、1.5 mL、400μL、550μL、950μL、2 mL、330μL、110μL），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表5。

表5 加樣回收率試驗結果（n＝6)Tab 5Results of recovery tests（n＝6)

續(xù)表5Continued tab 5

2.5.8 樣品含量測定 取5批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算其中8種成分的含量，結果見表6。

表6 樣品含量測定結果（n＝3，%%）Tab 6 Results of content determination of samples（n＝3，%%）

3 討論

本課題組前期通過均勻設計[5]，發(fā)現(xiàn)以60%乙醇提取淫羊藿總黃酮的效果最佳，由于淫羊藿總黃酮提取物中存在大量雜質(zhì)，故通過大孔吸附樹脂HPD-400進行純化除雜后，可獲得純度較高的總黃酮，經(jīng)測定其總黃酮平均含量為71.6%。

本試驗參考文獻[6-10]，采用HPLC法對5批已純化的淫羊藿總黃酮提取物建立了指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)有22個共有峰，各批樣品相似度均在0.99以上，質(zhì)量穩(wěn)定性良好。為進一步比較各批樣品間的含量差異，選擇標定指認的8個共有峰，建立含量測定方法。含量測定結果顯示，5批樣品中8種成分含量的RSD均小于5%，表明5批樣品含量差異不大，提取及純化工藝穩(wěn)定、可行。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜可為淫羊藿總黃酮提取物的質(zhì)量控制提供參考；所建含量測定方法簡便、準確、重復性好，可用于同時測定淫羊藿總黃酮提取物中8種成分的含量。