黑糯米酒及黑糯米保健酒品質分析

蘇 偉，母 雨，齊 琦，母應春，禹曉婷

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

近年來，隨著國民經濟水平和文化水平的提高，人們對于自身的健康問題越來越重視，健康飲食已然成為熱點。據報道，黑糯米中含有人體所需的多種營養物質[1-2]，具有補血、暖胃、補虛、健脾、促進人體微循環等多種生理功能[3]。保健酒是指在釀造過程中加入了中藥材或其他的營養成分[4]，對人體具有保健功能，但不以治療為目的的飲料酒，其必須具備三個屬性，即食品屬性、功能屬性、非藥品屬性[5]。黑糯米保健酒是以黑糯米為原料，加入藥食同源的物質為輔料，經過一系列加工工藝制作而成的營養豐富的飲品。

黑糯米相關產品已有悠久的歷史，但關于黑糯米的研究起步較晚。長久以來，黑糯米被添加到各種食品中，但都作為輔料，使得其產品附加值較低。目前對黑糯米的開發利用主要集中在黑糯米酒、黑糯米醋、黑糯米粑及黑糯米酥等具有地方特色的食品。而對于黑糯米酒的研究又集中于營養物質的消化吸收方面，尚未對黑糯米酒的功能成分進行系統分析。

本實驗采用AB-INOWAX色譜柱經氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術與超高效液相色譜-四級桿-軌道阱高分辨質譜聯用（ultra high performance liquid chromatography-Q exactive-orbitramass spectrometry，UPLC-QE-MS）測定黑糯米酒與黑糯米保健酒中的風味成分及化學成分，進行對比分析，找到黑糯米保健酒的特有成分，為黑糯米保健酒保健作用研究提供理論與數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑糯米：市售；糖化酶（酶活力10萬U/g）：北京索萊寶科學技術有限公司；增香酵母：四川瀘州市釀酒科學研究所；Z-20根霉曲：貴州輕工釀酒研究所；蘆丁標準品（純度≥98%）：成都曼思特生物科技有限公司；氯化鋁（分析純）：廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；氫氧化鈉（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器及設備

HP6890/5957C氣相色譜-質譜聯用儀、1290 UHPLC超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；Q Exactive Orbitra高分辨質譜：美國ThermoFisherScientific公司；PS-60AL超聲儀：深圳市雷德邦電子有限公司；KQ-300DE酶標儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

黑糯米酒的制備參照文獻[1]進行；黑糯米保健酒的制備參照文獻[3]進行。

1.3.2 黑糯米酒與黑糯米保健酒風味成分檢測

采用氣相色譜-質譜法檢測黑糯米酒與黑糯米保健酒風味成分。

樣品前處理：用微量注射器量取1 μL樣品溶液直接進樣。

氣相色譜條件：

色譜柱：AB-INOWAX（30 m×0.25 μm×0.25 mm）毛細管柱；柱溫：40℃，保留2min；升溫程序：5℃/min升至240℃，保持10 min，運行52 min；溶劑延遲時間：1 min；汽化室溫度：250℃；載氣：高純氦氣（He）；流量：1 mL/min；柱前壓：7.64psi；分流比：20∶1。

質譜條件：

離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 529 V；接口溫度280℃；質量范圍20～500 amu。

定性定量分析：用質譜計算機數據系統對總離子流圖中的各個出峰進行檢索，核對美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley 275標準質譜圖數據庫，確定化學成分。采用峰面積歸一化法計算各化學成分的相對含量。

1.3.3 黑糯米酒與黑糯米保健酒化學成分檢測

黑糯米酒與黑糯米保健酒化學成分檢測采用超高效液相色譜-四級桿-軌道阱高分辨質譜法。

樣品前處理：移取100 μL酒液至EP管中，加入300 μL甲醇（含內標），渦旋混勻30 s；超聲10 min（冰水浴）后于-20℃靜置1h；將酒液在4℃、12000r/min條件下離心15min；取上清液于進樣瓶中上機檢測。

超高效液相色譜條件：

色譜柱：UPLCHSST3色譜柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；進樣體積為1μL，洗脫程序見表1。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of UPLC

流動相組成：

正離子模式：流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為乙腈。

負離子模式：流動相A為5mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B為乙腈。

質譜條件：

Thermo Q Exactive Orbitrap質譜儀能夠在控制軟件（Xcalibur，版本：4.0.27）控制下進行一級、二級質譜數據采集。碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：20 eV、40 eV、60 eV，掃描速率：7 Hz。高分辨質譜參數見表2。

表2 質譜參數Table 2 Parameters of mass spectrometry

定性定量分析：使用ProteoWizard軟件將質譜原始數據轉成mzML格式。再使用XCMS做保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作。使用OSI-SMMS（version 1.0，大連達碩信息技術有限公司）軟件配合自建數據庫進行物質鑒定。采用峰面積歸一化法計算各化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 兩種黑糯米酒中風味化合物的GC-MS分析結果

采用氣相色譜-質譜聯用對黑糯米酒和黑糯米保健酒的風味成分進行分析，其總離子流色譜圖見圖1，各風味成分定性和定量分析結果見表3，兩種酒風味成分的種類及數量見圖2。

圖1 黑糯米酒（A）及黑糯米保健酒（B）風味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of flavor components in black glutinous rice wine(A)and black glutinous rice health wine(B)analyzed by GC-MS

表3 黑糯米酒與黑糯米保健酒中風味成分GC-MS分析結果Table 3 GC-MS analysis results of flavor components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

續表

由表3可知，在兩種酒中共檢出53種成分，包含醇類、酮類、酸類、酯類、醛類等，這些成分是構成酒香味成分的骨架和基礎，同時也是考察酒質量的主要依據之一[6]。

黑糯米保健酒中共檢測到45種香氣物質，其主體成分為醇類（39.519%）、酮類（19.467%）、醛類（15.075%）和酸類（9.611%）。主要揮發性物質有乙醇（32.318%）、1,3-二羥基丙酮（11.207%）、5-（羥甲基）糠醛（8.42%）、乙酸（6.518%）、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-4-酮（5.519%）、羥乙醛（4.302%）、甲酸（2.729%）、2-呋喃甲醇（2.569%）。

黑糯米酒中共檢測到47種香氣成分，其主體風味成分為醇類（57.284%）、醛類（13.161%）和酮類（11.36%）。主要揮發性物質包括乙醇（51.519%）、5-（羥甲基）糠醛（10.982%）、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-4-酮（5.542%）、1,3-二羥基丙酮（5.001%）、乙酸（2.969%）、丙三醇（2.244%）、2-呋喃甲醇（1.911%）。

圖2 黑糯米酒與黑糯米保健酒香氣成分種類及含量Fig.2 Types and contents of aroma components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

由圖2可知，黑糯米保健酒的酸類、醛類、酮類化合物含量高于黑糯米酒，醇類化合物含量低于黑糯米酒。這是由于醇的氧化或脫氫反應能生成醛、酮、酸，故黑糯米保健酒在生成更多醛、酮、酸類化合物的同時，其醇類化合物含量下降。

黑糯米保健酒主體風味成分中含量最大的物質分別是乙醇、1,3-二羥基丙酮、5-（羥甲基）糠醛和乙酸。其中，乙醇含量直接關系到酒精濃度，而長期飲用酒精度過高的酒易導致一系列疾病，如酒精性肝病[7]、酒精性心肌病[8]等。二羥基丙酮是一種天然存在的酮糖，具有生物可降解性，可食用且對人體和環境無毒害，是一種具有多功能的添加劑，可用于化妝品、醫藥及食品行業[9]。5-（羥甲基）糠醛被證明是補肝益腎作用的物質基礎之一[10]。乙酸作為白酒中主要的揮發性酸和調味酸，是構成白酒香氣的主要物質之一[11]。

2.2 兩種黑糯米酒UHPLC-QE-MS結果分析

采用超高效液相色譜-四級桿-軌道阱高分辨質譜聯用（UPLC-QE-MS）儀對黑糯米酒和黑糯米保健酒的化學成分進行鑒定，總離子流色譜圖見圖3和圖4。兩種酒的化學成分類別及相對含量見表4。

圖3 黑糯米保健酒中化學成分UPLC-QE-MS檢測基峰色譜圖Fig.3 Base peak chromatogram of chemical components in glutinous rice health wine analyzed by UPLC-QE-MS

圖4 黑糯米酒中化學成分UPLC-QE-MS檢測基峰色譜圖Fig.4 Base peak chromatogram of chemical components in glutinous rice wine analyzed by UPLC-QE-MS

表4 黑糯米酒與黑糯米保健酒中化學成分UPLC-QE-MS分析結果Table 4 UPLC-QE-MS analysis results of chemical components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

由表4可知，從兩種酒中共檢出534種化學成分，黑糯米酒含有527種化學成分，黑糯米保健酒含有529種化學成分。其中，黑糯米酒有一種特有氨基酸類物質，黑糯米保健酒有三種特有物質，包括兩種黃酮類和一種酸類物質。將所有化學成分分為低聚肽、氨基酸、黃酮、酚、醇、酸、酮及其他共8大類。除其他類外，兩種酒中含量最多的是氨基酸，其次是酸類和低聚肽；而物質種類最多的是低聚肽，其次是氨基酸和酸類。另外，兩種酒中僅黃酮類物質變化巨大，峰面積增長倍數超過30倍，其余幾類物質含量變化較小。

兩種酒中存在大量的氨基酸是由于富含蛋白質的黑糯米在經過浸泡、蒸煮、發酵后，大部分蛋白質水解為氨基酸。氨基酸不僅是合成蛋白的重要原料，而且為生長代謝提供了物質基礎[12]。如苯丙氨酸是參與腎及膀胱功能修復的主要物質[13]；異亮氨酸參與胸腺、脾臟及腦下腺的調節及代謝，腦下腺屬總司令部，作用于甲狀腺、性腺；賴氨酸不僅是肝、膽的組成成分同時還能促進大腦發育及脂肪代謝；色氨酸可促進胃液及胰液的產生；蛋氨酸（甲硫氨酸）可抑制霉菌，有著解毒的功能。無論哪一種氨基酸對于人體來說都是非常重要的，缺乏任何一種就會影響人體代謝的運行，導致疾病。與氨基酸相比，低聚肽的含量較低是因為黑糯米中僅有小部分蛋白質水解為分子質量更小的肽類物質。由≤10個氨基酸構成的小分子肽稱為低聚肽，也叫做寡肽，其具有較高的保健功能。研究發現，低聚肽具有增強機體免疫[14]、緩解疲勞、抗氧化、減輕慢性炎癥等功能[15]。鮑雷等[16]研究發現，吉林人參低聚肽可提高小鼠的性功能，顯著增加其性器官臟器指數。

酸類物質在兩種酒中均占其物質總量的20%左右，其中含量最大的是L-乳酸，分別占黑糯米酒和黑糯米保健酒中酸類物質總量的38.805%和45.441%。酸類物質能與醇類物質反應生成相應的酯類物質，從而賦予酒體香味。乳酸是一種天然有機酸，釀造過程中存在適宜濃度的乳酸既能降低pH促進糖化，又有利于酵母發酵，從而提高產品的質量和風味[17]。

黃酮類化合物有提高動物機體抗氧化及清除自由基的能力，可對人體腎臟起到一定的保護作用。在腎臟疾病發展過程中，氧化損傷是非常重要的一個因素，例如損傷腎小球基底膜、引起炎性反應和血小板聚集等相關腎臟疾病都與其息息相關[18]。由于氧化應激而引發的糖尿病腎病[19-20]以及腎小球和腎小管實質細胞凋亡導致腎功能的不斷惡化[21]，使得黃酮類化合物用作天然抗氧化劑來防治糖尿病的并發癥備受關注[22]。李海山等[23]發現類黃酮物質可降低染鉑大鼠腎損傷，或與其抗氧化活性相關。研究表明，糖尿病大鼠在經酸棗仁黃酮干預后，其氧化應激造成的腎損傷得到減輕，酸棗仁黃酮可抑制腎細胞凋亡，從而減輕腎損傷時的結構改變[24]。

結果表明，黑糯米保健酒的特有成分為雌馬酚、大豆苷元和甘草酸；黑糯米酒的特有成分為黃嘌呤。雌馬酚是大豆異黃酮的代謝產物，生物活性廣泛，具有抗氧化作用、免疫調控功能和保健功能。大豆苷元同屬于黃酮類化合物，是異黃酮的一種，研究發現大豆苷元可以有效的防止骨質疏松，防治前列腺癌，并可以降低對酒精的依賴度。甘草酸又稱甘草皂苷，是從天然植物甘草中提取的，是甘草的主要活性成分。動物實驗研究證實甘草酸對缺血再灌注性、梗阻性、高血糖性、藥物性（馬兜鈴酸、慶大霉素、順鉑、阿霉素、鎘等引起的）、變態反應性腎損傷都有保護作用，臨床研究肯定了甘草酸在治療腎綜合征出血熱中的療效[25]。黃嘌呤是嘌呤降解途徑的產物，并會在黃嘌呤氧化酶的作用下轉換為尿酸。故黑糯米保健酒中高含量的尿酸可能是由于其中的黃嘌呤全部轉化為尿酸。

相較于黑糯米酒，黑糯米保健酒中含量較大的成分有羥基香豆素和乙酰膽堿。羥基香豆素具有較強的解痙、鎮痛作用，同時也能溫和、持續地促進膽汁分泌，加強膽囊收縮和抑菌作用，具有明顯的利膽作用，還有利于結石排出，對膽總管結石有一定排石效果。臨床上主要用于膽囊炎、膽道感染、膽結石、膽道術后綜合征。乙酰膽堿是一種神經遞質，中樞膽堿能系統與學習、記憶密切相關，乙酰膽堿是中樞膽堿能系統中重要的神經遞質之一，其主要功能是維持意識的清醒，在學習記憶中起重要作用。

3 結論

通過GC-MS檢測到黑糯米保健酒中含有44種揮發性物質，主體風味成分為醇類（39.519%）、酮類（19.467%）、醛類（15.075%）和酸類（9.611%）；黑糯米酒中共檢測到47種香氣成分，其主體風味成分為醇類（57.284%）、醛類（13.161%）和酮類（11.36%）。黑糯米保健酒的醛、酮、酸類化合物含量高于黑糯米酒，而醇類化合物含量低于黑糯米酒，這是因為醛、酮、酸類物質來源于醇類物質的氧化或脫氫反應。

通過UPLC-QE-MS從黑糯米保健酒中共檢出529種化學成分，主體化學成分為氨基酸（42.671%）和酸類（20.383%）；從黑糯米酒中檢出527種化學成分，其主體化學成分同樣是氨基酸（37.708%）和酸類（18.431%）。與黑糯米酒相比，黑糯米保健酒中黃酮類物質含量增加30余倍，其特有成分為雌馬酚、大豆苷元和甘草酸，含量較大的成分有羥基香豆素和乙酰膽堿。