永康高山綠茶超高效液相色譜指紋圖譜研究

楊 璐，支紅峰，胡中豪

（永康市食品藥品檢驗檢測中心，浙江永康321300）

永康地處浙江省中部，擁有較多山地和丘陵，氣候溫和，四季分明，利于茶葉生長種植。目前，永康擁有大寒山、毛虎山等生產基地，茶園總面積超過500畝，2018年茶葉總產量約14.5 t。憑借良好的地理優勢與生態環境，經過多年的開發與研制，已經擁有“寒峰有機綠茶”、“永康紅”等知名產品。由于受氣候、環境、加工工藝等因素的影響，茶葉品質會出現一定的差異。

指紋圖譜分析作為目前一種成熟的分析技術，可對已知和未知的成分做出全面的表征，適用于中藥及中藥制劑真偽鑒別、質量控制以及新產品開發等[1-3]，近年來也逐漸在茶葉品質控制上得到應用[4-11]。通過對茶葉品質做出可量化的評價，可以有效彌補“感官評價”存在的帶有較強主觀性、缺乏科學實驗研究基礎，且評價結果易受環境條件、設備條件、品評方法等因素影響的缺陷，是一種更科學、有效的控制及評價茶葉品質的方法。其中，色譜法應用最為廣泛，發展迅猛[12]。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）由于其靈敏度高、分離效果好等特點，相較于普通液相色譜更有優勢[13-14]。

關于永康高山綠茶指紋圖譜的研究尚未見報道，本研究利用超高效液相色譜法初步構建了永康高山綠茶UPLC指紋圖譜，以期為品質控制提供客觀依據，同時也為后期的良種選育提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶樣品1#、2#、8#產自永康毛虎山，3#～7#、9#～10#、14#～15#產自永康大寒山、16#產自永康盤龍谷；11#～13#來自安徽蕪湖，分別為碧螺春茶和2個炒青茶。

茶氨酸（theanine，T）（99%）、沒食子酸（gallic acid，GA）（99.9%）、可可堿（theobromine，TB）（99.9%）、咖啡因（caffeine，CAF）（500 mg/L）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）（98.1%）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）（99.4%）、兒茶素（catechin，C）（99.3%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，EGCG）（99%）、表兒茶素（epicatechin，EC）（96.7%）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）（98.1%）、三氟乙酸（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

甲醇（色譜純）：美國Tedia公司；無水乙醇（色譜純）：天津賽孚瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設備

WatersUPLCI-class超 高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）：美國Waters公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；Allefra 64R臺式高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；BSA 822電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

茶葉樣品粉碎后取0.20 g，加入20 mL體積分數20%的乙醇水溶液，渦旋混合均勻，于水浴恒溫振蕩器中70℃、200 r/min提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用水定容至25 mL，溶液經0.22 μm濾膜過濾后上機分析。

分別稱取茶氨酸、沒食子酸、可可堿、咖啡因、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯適量標準品，用無水乙醇配制成質量濃度為1.00 mg/mL儲備液備用。

1.3.2 色譜條件

島津Shim-pack XR-ODSⅡ色譜柱（2.0 mm×150 mm，2.2 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫30℃；流動相A為0.05%三氟乙酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見表1；檢測波長0～3 min為203 nm，3～9 min為280 nm。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 方法學考察

取同一綠茶樣品，按1.3.1制備，取同一樣品提取液6份，在1.3.2的色譜條件下分析，計算峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的精密度；取同一樣品提取溶液分別于0、4 h、8 h、16 h、24 h測定，計算RSD值，考察方法的穩定性。在綠茶樣品中分別添加3份濃度不等的標準混合液，測定各目標成分的回收率。

1.3.4 數據分析

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A版）軟件對數據進行分析，生成共有模式，進行相似度評價。使用SPSS 22.0軟件對樣品進行聚類分析和判別分析。

2 結果與分析

2.1 UPLC方法學考察

方法的精密度和穩定性試驗結果見表2，加標回收試驗結果見表3。結果表明，在精密度實驗中，UPLC圖譜中的各個共有峰的保留時間和峰面積的相對標準偏差分別小于0.06%和3.4%，方法精密度良好；在穩定性實驗中，24 h內，各共有峰的保留時間和峰面積的RSD值分別小于0.8%和5.0%，說明該方法制備的綠茶提取液在24 h內基本穩定。加標回收實驗中，茶氨酸等10種組分3水平的平均加標回收率在89.2%～110.4%范圍內，其RSD值在0.9%～3.9%之間，符合檢測方法對回收率的要求。

表2 精密度與穩定性試驗結果Table 2 Results of precision and stability tests

表3 10種成分的加標回收率試驗結果Table 3 Results of adding standard recoveries tests of 10 components

2.2 UPLC指紋圖譜構建

在同一色譜條件下對13批次樣品進行測試，所得色譜圖數據經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統分析，得到13個綠茶樣品的指紋圖譜（圖1）和共有模式（圖2）。

選擇相對穩定、出峰時間適中且峰面積較大的15號色譜峰為參照峰，分別計算各樣品中其余組分峰的相對保留時間以及相對峰面積。各組分峰按相對保留時間一一匹配后共得到18個共有峰。但有研究發現在出峰密集的情況下，僅用相對保留時間作為定性，結果并不完全可靠，需要進一步驗證[15-16]。利用二極管陣列檢測器對各色譜峰進行光譜掃描（190～400 nm）可作為共有峰的輔助識別。將各樣品中的18個共有峰最大吸收波長兩兩進行比較，其中8、13、15號色譜峰的最大吸收波長稍有差異（＜10 nm），但其全波長掃描圖譜形狀基本一致，可認為是同一種物質。其余15個共有峰之間的差異均＜5 nm。因此，通過光譜分析驗證13個永康綠茶樣品指紋圖譜中共有18個共有峰，其最大吸收波長和相對保留時間見表4。

圖1 13個永康綠茶樣品的UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprint of 13 Yongkang green tea samples

圖2 永康綠茶UPLC指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of UPLC fingerprint of Yongkang green tea

表4 13個綠茶樣品共有峰的最大吸收波長和相對保留時間Table 4 Maximum absorption wavelength and relative retention time of common peaks of 13 Yongkang green tea samples

經與標準品比較，確定了9個峰的組分：峰3為茶氨酸，峰8為沒食子酸，峰9為沒食子兒茶素，峰11為可可堿，峰14為表沒食子兒茶素，峰15為表沒食子兒茶素沒食子酸酯，峰16為咖啡因，峰17為表兒茶素，峰18為表兒茶素沒食子酸酯。且各色譜峰與其對應的標準品峰最大吸收波長一致。18個共有峰面積占總峰面積比例約為95%，基本涵蓋了綠茶內在的化學信息。

2.3 相似度評價

經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）軟件計算，13個永康本地綠茶樣品與其共有模式的相似度分別為0.990、0.988、0.990、0.990、0.988、0.996、0.992、0.988、0.985、0.989、0.994、0.988、0.984，相似度均＞0.98，符合指紋圖譜的要求，說明永康本土綠茶化學成分相似、質量穩定。

2.4 不同產地綠茶的聚類分析和判別分析

數據采用歐式最短距離法對不同產地的綠茶進行聚類分析，結果見圖3。由圖3可知，當臨界值為5時，16個茶樹樣品可以分為2大類。其中，來自永康本地的聚成一類，安徽蕪湖的3個樣品聚成一類。來自安徽的碧螺春茶和炒青茶的加工工藝與永康本地高山綠茶加工工藝相似，主要經過殺青、揉捻、干燥三個步驟，聚類分析結果表明，永康本地高山綠茶與來自安徽蕪湖的綠茶樣品內在化學成分存在一定差異，可用聚類分析手段進行初步篩分。

圖3 不同產地綠茶的聚類分析結果Fig.3 Cluster analysis results of green tea samples from different regions

本實驗分為兩分類典則判別，Wilkλ值為0.001，卡方為48.811，P值為0.000，判別函數具有統計學意義。根據Fisher判別函數得到兩類樣品的校正集判別與聚類分析結果完全一致，省外3個綠茶樣品判為一類，其余13個永康綠茶樣品判為一類。整體判別模型穩定，同時也進一步確認了聚類分析的可靠性。

3 結論

本試驗采用UPLC指紋圖譜分析手段得到了永康高山綠茶內在化學成分的綜合信息，并通過保留時間定性和光譜掃描等方式確定了18個共有峰，同時確定了響應值最高的9個峰的成分。該圖譜可有效反映永康高山綠茶內在成分的相似性。通過聚類分析和判別分析進一步證實該指紋圖譜的穩定性與專一性，可作為永康高山綠茶質量控制與評價的重要依據。此外，綠茶品質易受產地環境、加工工藝等多個因素的影響，后續研究可參考本試驗建立的指紋圖譜，結合質譜等儀器方法完善指紋圖譜信息，并將永康高山綠茶做進一步甄別研究與選育研究。