生姜提取物抗氧化應激的實驗研究

粟 君，馬 萍，羅建勛，賈亞楠，徐 立

氧化應激（oxidative stress）是指體內氧化與抗氧化作用失衡，產生大量氧化中間產物，引起一系列的氧化反應。氧化應激是由自由基在體內產生的一種負面作用，并被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素[1]。氧化應激與多種人類疾病有關，如癌癥、帕金森病、阿爾茨海默癥、動脈粥狀硬化、心力衰竭、心肌梗塞等[2]。部分天然植物產物有很好的抗氧化應激作用，如生姜中的生姜精油，姜辣素，生姜酮等化學成分，均具有抗氧化應激的作用；酚羥基化合物具有還原性，能夠清除氧自由基[3]。本研究探討了生姜提取物對H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)氧化應激損傷的預防保護作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 生姜購買于重慶農貿批發市場，產地為重慶，品種為渝姜1號，烘干、粉碎、備用；乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚（重慶鈦新化工有限公司，AR）；CCK-8試劑盒（索萊寶生物科技有限公司）；DMEM 培養基（Hyclone公司）；胰蛋白酶、滅活胎牛血清（杭州四季青公司）；HUVEC（上海默賽飛生物科技有限公司）。

KQ700DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XT-100高速多功能粉碎機（浙江永康市紅太陽機電有限公司）；R-210/215旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司）；DLSB-10L/20冷卻循環真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Lab-1C-50E冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；I Mark酶標儀（Bio-Rad）；HERA cell 150 型 CO2培養箱(美國 Thermo公 司)；OptimaL-100XP 型 超 速 離 心 機 （Beck-man）；TS100型倒置生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 生姜提取物的制備 采用系統溶劑分離法，由親脂性到親水性或低極性到高極性的次序組成溶劑系統，依次提取分離不同活性組分。將適量生姜粉（40目）加入100%乙醇，浸泡3 h，收集上清液，得到總提取物；再用石油醚、丙酮和乙酸乙酯等有機溶劑萃取分離提取液，得到不同的組分。

1.3 細胞培養 5%CO2、37℃恒溫培養箱中常規培養HUVEC細胞，每2～3 d消化傳代1次。待細胞鋪滿培養瓶底約80%時，棄培養液，PBS洗滌細胞1遍，0.25%胰蛋白酶液消化2～3 min，加少量含血清的新鮮培養液，終止消化。吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成單細胞懸液。在細胞懸液中加新鮮細胞培養基，5%CO2、37℃培養，選取對數生長期的細胞用于以下實驗。

1.4 氧化應激損傷細胞模型的建立 選取對數生長期的 HUVEC，調整為 5.0×104個/ml，接種于 96 孔細胞板上，200 μl/孔，5%CO2、37 ℃培養 24 h。 分別加入終濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L 的 H2O2，繼續培養4 h后，采用CCK-8還原法檢測細胞存活率。每組設3個復孔，結果取平均值，計算不同濃度H2O2對細胞增殖的抑制率（%），以細胞增殖抑制率為50%（IC50）的 H2O2濃度作為后續實驗的H2O2濃度。

1.5 生姜提取物抗氧化應激實驗 以硫辛酸為陽性對照藥物，將HUVEC隨機分為陽性對照組（硫辛酸濃度分別為 0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml）和生姜總提取物組(生姜總提取物濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)。均預培養24 h后，加入1 mmol/L H2O2誘導氧化應激損傷，繼續孵育4 h后，采用CCK-8還原法檢測細胞存活率。每組設3個復孔，結果取平均值。

根據上述實驗結果，以生姜總提取物抗氧化應激作用最強濃度，確定生姜提取物各組分的實驗濃度，進行抗氧化應激實驗，方法同上。

1.6 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件分析，實驗數據以±s表示，組間比較采用方差分析和兩兩比較t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生姜提取物結果 得到總提取物和F1～F6共6個組分。總提取物為具有生姜刺激性氣味的稠膏，棕褐色；F1～F6組分為棕褐色透明液體。

2.2 不同濃度H2O2對HUVEC增殖的抑制作用隨著H2O2濃度的增加，H2O2對HUVEC增殖抑制作用逐漸增強，呈現出濃度依賴性，H2O2誘導HUVEC氧化應激損傷的IC50為1 mmol/L。見表1。

2.3 生姜提取物抗氧化應激實驗結果 無論是作為陽性對照藥物的硫辛酸，還是生姜總提取物，均隨著給藥濃度的增加，HUVEC增殖率逐漸增強，提示抗H2O2氧化應激損傷的所用逐漸增強，并且均呈現出濃度依賴性。見表2。

因為生姜總提取物抗氧化應激作用最強濃度為10 mmol/L，所以確定生姜提取物各組分的實驗濃度也為10 mmol/L，進行抗氧化應激實驗。結果顯示，隨著組分極性的增加，H2O2對HUVEC增殖的抑制作用逐漸降低，細胞增殖率逐漸增大，以F5組分的抗氧化應激活性最高（表3）。

表1 不同濃度H2O2對HUVEC增殖的抑制作用(%)

表2 陽性對照組與生姜總提取物組細胞增殖率比較

表3 生姜提取物各組分抗氧化應激實驗結果

3 討論

氧化應激是由自由基在體內引起的一種負面作用，并被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素[4]。氧在細胞代謝過程中部分還原為活性氧（ROS），在氧化應激中，ROS似乎參與了觸發或維持疾病狀態[5]。

生姜的主要化學成分有姜精油、姜辣素和二苯基庚烷類化合物，如4-姜烯酚shogaols和姜酮Zingerone B[6]。二苯基庚烷類化合物有多種藥理活性，如抗氧化應激和細胞毒活性。何文珊等[7]從生姜中分離出一個新的二苯基庚烷類化合物，并且證明此化合物有很強的抗氧化應激活性。王麗[8]對母姜與子姜化學成分分析及其抗氧化活性研究表明，生姜清除DPPH自由基能力強的組分，大部分集中在中等極性偏上部位。

本研究共得到生姜總提取物和F1～F6共6個組分。總提取物為具有生姜刺激性氣味的稠膏，棕褐色；F1～F6組分為棕褐色透明液體。抗氧化應激實驗結果也證實，生姜總提取物具有顯著的抗氧化活性，且其抗H2O2氧化應激損傷的強度與硫辛酸相同，并且也呈現出濃度依賴性。

在生姜提取物F1～F6共6個組分中，F1、F2和F3屬于低等極性和中等極性的組分，F4屬于中等偏上極性的組分，F5、F6屬于高等極性的組分。進一步分析生姜提取物各組分的抗氧化應激活性發現，隨著組分極性的增加，抗氧化應激活性逐漸增大，以F5組分的抗氧化應激活性最高。與王麗[8]對生姜抗氧化活性研究結果相似，即抗氧化應激活性最強的組分，屬于中上極性部位。F6組分抗氧化應激活性低，可能是由于F6組分屬于各組分提取后剩余部分，所含抗氧化應激物質較少有關。

綜上所述，生姜提取物具有較強的抗氧化應激作用，可減輕H2O2誘導的HUVEC氧化應激損傷；各提取物中，以F5組分的抗氧化應激活性最強。