利用生物三維打印技術修復軟骨損傷的研究進展

韓倩倩 王苗苗 史建峰 王迎 連環 王蕊 李靜莉 王春仁

【提要】 軟骨組織因缺乏血供，自我修復能力極其有限，導致軟骨損傷后難以再生修復。生物三維打印技術突破了傳統組織工程技術仿生功能設計的局限性，可一體化成型并精確制備復雜結構，還可以將細胞打印于支架材料中，構建適合細胞生存的微環境，在軟骨修復和再生領域具有優勢。本文對生物三維打印技術修復軟骨的研究進展進行綜述。

生物三維打印是三維打印在生物醫學領域的一個分支。生物三維打?。˙io-3DP）是采用生物材料、細胞或生長因子等活性物質進行打印，目的是為了構建復雜的生物三維結構，并使其具有生物活性，最終獲得與目標組織或生物器官接近、相同甚至更優越的功能。目前，生物三維打印技術主要包括擠出式、低溫沉積、細胞打印等[1]。

全球3D 打印行業中，歐美最為發達，美國的3D 打印已形成了產業化[2]。我國政府十分重視3D 打印產業的發展，將其作為《中國制造2025》的重點發展項目之一。2017 年，工業和信息部等12 個部門聯合印發 《增材制造產業發展行動技術（2017～2020 年）》，提出至2020 年我國增材制造產業年銷售收入超200 億元，關鍵核心技術達到國際水平，工藝裝備基本滿足行業需求，在部分領域實現規?；瘧茫七M增材制造在各制造領域的示范性應用[3]。但與美國等達國家相比，我國仍處于3D 打印技術的起步階段，需要進一步突破。

1 軟骨修復的重要性及現階段難點

我國每年因為疾病、意外等導致骨折或骨損傷的人數日益增多，加上物質生活水平的提高，肥胖導致的關節軟骨磨損患者也日益增多。軟骨中的細胞外基質（軟骨基質）富含Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖，在生理軟骨中形成致密的網狀物，含有大量的水，產生足夠的機械強度[4]。疾病或各種損傷引起的骨、軟骨、關節創傷可導致人體功能缺陷，盡管骨組織具有強大的自愈能力，但僅可在一定的缺損范圍內發揮作用[5]。軟骨組織沒有血供系統，只能依賴關節液提供養分，限制了軟骨組織的自我修復[6]。

軟骨缺損的修復一般采用藥物、手術、物理等治療方法，但均存有不足。例如，藥物治療主要是通過口服或關節腔注射給藥，僅可部分減輕因關節軟骨損傷而引發的疼痛，總體治療效果有限，僅對輕度損傷有效，且副作用較為強烈，不適宜長期使用。物理治療所需時間長且效果有限，與其他方法相比不具有明顯優勢，一般只作為輔助治療方法。手術方法種類較多，包括軟骨下骨鉆孔術、鑲嵌成形術、自體骨軟骨移植、同種異體移植、異體骨軟骨移植、攝取特殊軟骨促進自體軟骨再生等，其中自體骨軟骨移植現被認為是臨床治療的金標準[7]。治療方法通常根據年齡、性別、受傷部位以及損傷的直徑和深度等因素進行選擇。許多患者通常需要關節鏡手術甚至關節置換術。上述手術方法還存有免疫排斥、術后關節炎癥、術后效果不理想等問題。軟骨修復至今仍然是臨床面對的一個巨大的挑戰[8-9]。

上世紀80 年代以來，組織工程技術的迅速發展，為這一難題的解決提供了新的可能性。組織工程從理論上建立了一種治療軟骨缺損的理想方法，但至今仍有部分關鍵問題亟待解決，還無法真正地應用于臨床[10]。

2 生物三維打印技術在軟骨修復領域的優勢

生物三維打印技術突破了傳統組織工程技術生物功能設計的局限性，可精確控制細胞在支架材料中的定點分布，微觀上構建具有適合細胞生存的微環境，為細胞提供真正的三維均衡生長環境，使得骨軟骨再生成為可能。生物3D 打印技術發展迅猛，在生物醫學領域，三維打印技術因其快速成型和構建復雜形狀的能力表現出無可比擬的優勢[11]。在骨科領域，可將患者虛擬的影像迅速轉換成三維實體物件，也可以實現材料結構的個性化定制以及與病變部位的解剖學匹配，已廣泛應用于骨科疾病的診斷、治療和康復。尤為重要的是，三維組裝細胞和材料的生物打印技術使組織再生修復更有效率，具有廣闊的應用前景[12]。

軟骨的修復不僅是軟骨層，也包含軟骨和松質骨之間的過度結構的修復。生物三維打印可以制備復合材料和梯度成分的多層次復雜結構的支架材料，借助生物三維打印機對損傷部位進行針對性、個性化打印，這種復合梯度材料將有助于軟骨的多層結構的修復。與以往的骨及軟骨修復材料相比，生物三維打印的骨及軟骨的組織工程支架具有生物相容性好、免疫排斥低、精度高等優點，可能是今后臨床進行軟骨缺損修復的完美手段。

3 利用生物三維打印技術進行軟骨修復的生物材料

3.1 天然高分子修復材料

纖維蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白、藻酸鹽、殼聚糖（CTS）、硫酸軟骨素、透明質酸、瓊脂糖等材料，均具有良好的生物相容性，其降解產物可被機體代謝吸收，但具有降解速率過快、力學強度低等缺點[7]。

3.2 人工合成高分子修復材料

聚己酸內酯（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）、β-磷酸三鈣（β-TCP）和羥基磷灰石（HA）等常用于軟骨缺損的修復。這類修復材料具有相對分子質量滿足不同需求、機械性能優異、生物相容性良好和易塑性等優點，缺點是親水性較差。

3.3 復合修復材料

復合材料是由具有良好生物相容性的天然高分子材料與具有優異機械性能的人工合成高分子材料制得的復合而成，可以起到優勢互補的作用，如聚氨酯/透明質酸、脫乙酰殼聚糖-明膠凝膠支架等[13]。

3.4 納米材料

納米相陶瓷、碳納米管等材料在軟骨組織工程的應用已有大量報道。相關研究表明，納米材料在軟骨組織工程領域有著潛在的應用前景。例如，納米相陶瓷，特別是納米羥基磷灰石，由于它能促進礦化的形成，而成為骨的替代材料。羥基磷灰石納米晶體與膠原成分組成的復合材料是最接近天然骨結構的組織工程材料。軟骨是由軟骨細胞和膠原纖維、蛋白多糖以及彈性蛋白纖維組裝的高密度納米結構的細胞外基質組成，再生能力較低。而納米技術對傳統的軟骨組織工程材料進行改造，產生納米組織工程材料，是生物仿生支架的一種，具有獨特的生物學性能。應用在骨和軟骨組織工程中的納米材料不僅需要良好的機械性能，還需具有能提高骨細胞和軟骨細胞功能的納米結構[14]。

4 利用生物三維打印技術修復軟骨的國內外研究進展

利用三維打印技術制備軟骨修復支架材料是構建人工軟骨的核心，也是軟骨組織工程領域研究的熱點。

4.1 國外研究現狀

Yi 等[15]通過整合三維打印技術和組織工程方法，建立了以計算機輔助設計系列程序為基礎，生成定制鼻腔植入物的三維模型，并通過3D 打印機進行模型的制作。Liu 等[16]將動態液體靜電紡絲制造的取向聚（L-乳酸）-聚（ε-己內酯）P（LLA-CL）/Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）納米纖維紗網作為冷凍干燥的膠原Ⅰ/透明質酸（HA）軟骨相（海綿）的骨架，以提高支架的機械強度。體外結果顯示，Yarn Col-I/HA 雜合支架（Yarn-CH）可以象海綿支架一樣使細胞浸潤。使用多孔β-TCP 作為骨相，然后通過冷凍干燥組裝Yarn-CH/TCP 雙相支架。結合BMSC 后，雙相復合物成功用于修復兔軟骨缺損。Yang 等[17]將與海藻酸鈉混合的Ⅰ型膠原或瓊脂糖摻入軟骨細胞以構建體外3D 打印的軟骨組織，海藻酸鈉/Ⅰ型膠原有效抑制了軟骨細胞的去分化，保留了表型。You 等[18]使用補充有熱/浸沒離子交聯過程的3D 生物繪圖技術來制造6 種水凝膠支架幾何形狀，并研究了它們對機械性能的影響。結果表明，水凝膠支架的機械性能可以通過改變內部結構參數來調整，包括股線方向和股線之間的間距。Ahn 等[19]將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽固定在聚丙烯富馬酸酯（PPF）支架上，用于調節支架上細胞之間的相互作用。顯微鏡觀察和組織學分析發現，支架上細胞正常增殖，說明具有固定化RGD 肽的基于PPF 的生物相容性支架可有效支持人軟骨細胞的初始黏附和增殖。這種3D 生物可印刷支架可提供促進軟骨組織再生的機會。Markstedt 等[20]結合納米原纖化纖維素（NFC）的突出的剪切稀化特性和海藻酸鹽的快速交聯能力，將其用于具有細胞的活體軟組織的3D 生物打印，證明了納米纖維素在活組織和器官3D 生物打印中的潛在用途。Kon 等[21]等將切碎的自體軟骨片段加載到由透明質酸（HA）衍生的膜、富含血小板的纖維蛋白基質（PRFM）和纖維蛋白膠組成的支架上。研究的目的是在體外證明軟骨細胞從軟骨碎片向這個支架的生長，并在山羊骨軟骨缺損中達到功能性修復。

4.2 國內研究現狀

王瑩瑩等[22]構建一種脫細胞軟骨/GelMA 復合材料支架用于修復軟骨缺損，該材料溶脹率低，力學強度稍強，BMSC能在支架上黏附并增殖；通過可注射型脫細胞軟骨/GelMA 復合材料制備的支架具有低免疫原性，適宜的儲能模量，良好的生物相容性，適用于軟骨修復。毛景洋等[23]發明了一種可直接3D 打印的氫鍵增強的高強度水凝膠墨水，并且模擬軟骨-骨的一體化結構，利用多噴頭交替打印制備成底層含有β-TCP、頂部含有若干層負載生長因子TGF-β1 的梯度支架。體內實驗表明，該雜化梯度水凝膠支架可同時促進軟骨和軟骨下骨再生。林祥龍等[24]在壓縮應變下，將絲素蛋白/Ⅱ型膠原蛋白復合支架與軟骨細胞共培養，結果表明，在10%的壓縮應變作用下，軟骨細胞在絲素蛋白/Ⅱ型膠原蛋白復合支架上增殖良好，該支架可用于修復軟骨缺損。黃彰等[25]將BMSC 誘導的軟骨細胞與聚乙醇酸-乳酸共聚物（PLGA）-Ⅱ型膠原支架通過管帽結構復合，構建組織工程軟骨復合體，有效修復了兔膝關節骨、軟骨損傷，新生軟骨、骨與宿主軟骨、骨及新生軟骨與軟骨下骨各界面耦合良好。彭晨健等[26]的研究表明，3D 打印β-磷酸三鈣復合淫羊藿苷支架植入股骨頭壞死的兔體內，可促進成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞活性，同時促進新生血管生成，具有促進兔股骨頭壞死修復的作用。徐燕等[27]的研究顯示，采用3D 打印技術制備經多巴胺表面修飾及負載CDMP-1 的PCL-HA 三維多孔支架，體外與hBMSC共培養，可促進細胞黏附、增殖及成軟骨分化。阮世強等[28]將雙層聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物支架材料復合慢病毒介導人骨形態發生蛋白2 轉染的兔脂肪干細胞修復骨、軟骨缺損。結果可顯著促進骨、軟骨缺損的修復。

5 總結

生物三維打印為多組分、多梯度的復合材料的制備提供了新的技術方法，同時可以制備復雜結構和個性化結構，為軟骨修復提供了新的策略。